Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт.Сез чикләнгән CSS ярдәме белән браузер версиясен кулланасыз.Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та туры килү режимын сүндерегез).Моннан тыш, дәвамлы ярдәмне тәэмин итү өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәбез.
Слайдка өч мәкалә күрсәтүче слайдерлар.Слайдлар аша хәрәкәт итү өчен арткы һәм киләсе төймәләрне кулланыгыз, яки һәр слайд аша хәрәкәт итү өчен ахырдагы слайд контроллер төймәләрен кулланыгыз.

317 Дат басмас корыч кәтүк торбалар белән тәэмин итүчеләр

Датсыз корыч материалның химик составы

SPACA6 - сперма белән күрсәтелгән өслек протеины, имезүчеләрнең җенси үрчү вакытында гамета кушылуы өчен бик мөһим.Бу төп рольгә карамастан, SPACA6ның конкрет функциясе начар аңлашыла.Без SPACA6-ның күзәнәктән тыш доменының кристалл структурасын 2,2 Å резолюциясендә аңлатабыз, дүрт юллы бәйләнештән торган ике доменлы протеинны һәм кваз-сыгылмалы бәйләүчеләр кушылган Иг сыман sand сандугачларны ачыклыйбыз.Бу структура IZUMO1 охшаган, тагын бер гамете кушылу белән бәйле протеин, SPACA6 һәм IZUMO1 ашлама белән бәйле аксымнар суперфамилиясенә нигез салучы әгъзалар булып, монда IST суперфамилия дип атала.IST суперфамилия структур яктан аның борылган дүрт геликс бәйләнеше һәм парлы диффид белән бәйләнгән CXXC мотивлары белән билгеләнә.Кеше протеомының структурасына нигезләнгән AlphaFold эзләү бу суперфамилиянең өстәмә протеин әгъзаларын ачыклады;игътибарга лаек, бу протеиннарның күбесе гамета кушылуда катнаша.SPACA6 структурасы һәм аның IST гаиләсенең башка әгъзалары белән мөнәсәбәтләре имезүчеләрнең гаме кушылуы турындагы белемнәребездә югалган сылтаманы тәэмин итә.
Humanәрбер кеше тормышы ике аерым гаплоид гаметасы белән башлана: әти спермасы һәм ана йомыркасы.Бу сперма көчле сайлау процессының җиңүчесе, бу вакытта миллионлаган сперма күзәнәкләре хатын-кыз җенес тракты аша уза, төрле киртәләрне җиңә һәм сыйдырышлыкны кичерә, бу аларның хәрәкәтен һәм өслек компонентлары процессын көчәйтә2,3,4.Сперма һәм ооцит бер-берсен тапсалар да, процесс әле тәмамланмаган.Ооцит кумулус күзәнәкләре катламы һәм зона пеллюсида дип аталган гликопротеин барьеры белән әйләндереп алынган, алар аша сперма ооцитка керергә тиеш.Сперматозоа бу соңгы киртәләрне җиңәр өчен өслеккә ябышу молекулалары һәм мембраналар белән бәйле һәм яшерен ферментлар кушылмасын куллана5.Бу молекулалар һәм ферментлар, нигездә, эчке мембранада һәм акросомаль матрицада саклана һәм акросомаль реакция вакытында сперманың тышкы мембранасы лизизацияләнгәндә ачыклана6.Бу көчле сәяхәтнең соңгы адымы - сперма-йомырка кушылу вакыйгасы, анда ике күзәнәк мембраналарын берләштерә, бер диплоид организмга әйләнәләр7.Бу процесс кеше үрчүендә нигез салса да, кирәкле молекуляр тәэсирләр начар аңлашыла.
Гаметаларның ашламасына өстәп, ике липид билайерның кушылу химиясе киң өйрәнелгән.Гомумән алганда, мембраналар кушылуы - энергия өчен уңайсыз процесс, ул протеин катализаторыннан структур конформация үзгәрүен таләп итә, бу ике мембрананы якынайта, өзлексезлеген боза һәм кушылуга китерә.Бу протеин катализаторлары фузогеннар дип атала һәм сансыз кушылу системаларында табылган.Алар кабул итүче күзәнәкләргә вируслы керү өчен кирәк (мәсәлән, gp160 ВИЧ-1, коронавируслар, грипп вирусларында гемагглутинин) 10,11,12 плаценталь (синцитин) 13,14,15 һәм аскы эукариотларда гаме формалаштыргыч кушылмалар ( Plantsсемлекләрдә, протистларда һәм артроподларда HAP2 / GCS1) 16,17,18,19.Кеше гаметалары өчен фузогеннар әле ачылырга тиеш түгел, гәрчә берничә протеин гаме бәйләнеше һәм кушылу өчен критик булып күрсәтелгән.Ооцит белән күрсәтелгән CD9, трансмембрана протеины, тычкан һәм кеше гаметаларының кушылуы өчен кирәк булган, беренче булып 21,22,23 ачылган.Аның төгәл функциясе аңлашылмаса да, ябышуда роль, йомырка микровиллында ябышу үзәкләренең структурасы, һәм / яки ооцит өслеге белгечләренең дөрес локализациясе, мөгаен, 24,25,26.Гамета кушылуы өчен иң мөһим ике протеин - IZUMO127 спермасы протеины һәм JUNO28 ооцит белок, һәм аларның үзара берләшүе гаметаны тану һәм кушылу алдыннан ябышу өчен мөһим адым.Ир-ат Изумо1 нокаут тычканнары һәм Джуно нокаут тычканнары бөтенләй стериль, бу модельләрдә сперма перивителлин киңлегенә керә, ләкин гаметалар кушылмый.Шулай ук, гаметалар анти-IZUMO1 яки JUNO27,29 антителалар белән эшкәртелгәндә, витро ашлама экспериментларында кимеде.
Күптән түгел, фермотипик рәвештә IZUMO1 һәм JUNO20,30,31,32,33,34,35 охшаган сперма белән күрсәтелгән аксымнар төркеме табылды.Сперма акросомаль мембрана белән бәйле протеин 6 (SPACA6) зур масштаблы мурин мутагенез тикшерүендә ашлама өчен кирәк дип билгеләнде.Трансгенны Spaca6 генына кертү яраксыз сперматозоаны чыгара, гәрчә бу сперматозоа перивителлин киңлегенә үтеп керә.Тычканнардагы соңрак нокаут тикшеренүләре Spaca6 гамете кушылуы өчен 30,32 кирәклеген раслады.SPACA6 тестларда гына диярлек күрсәтелә һәм IZUMO1ныкына охшаган локализация үрнәге бар, ягъни акросомаль реакция алдыннан сперматозоа интимасында, аннары акросомаль реакциядән соң экватор өлкәсенә күченә 30,32.Spaca6 гомологлары төрле имезүчеләрдә һәм башка эукариотларда бар, һәм аның кеше гаметасы кушылуы өчен мөһимлеге SPACA6 30 каршылыгы белән витрода кеше ашламасын тыю белән күрсәтелде.IZUMO1 һәм JUNOдан аермалы буларак, SPACA6 структурасы, үзара бәйләнеше, функциясе детальләре аңлашылмый кала.
Кеше спермасы һәм йомыркаларның кушылуы нигезендәге төп процессны яхшырак аңлау өчен, бу безгә гаилә планлаштыру һәм уңдырышлылыкны дәвалаудагы киләчәк вакыйгалар турында хәбәр итәргә мөмкинлек бирәчәк, без SPACA6 структур һәм биохимик тикшеренүләр үткәрдек.SPACA6-ның күзәнәктән тыш доменының кристалл структурасы дүрт вертикаль бәйләнешне (4HB) һәм квази-сыгылучан төбәкләр белән бәйләнгән иммуноглобулинга охшаган (Иг сыман) доменны күрсәтә.Элеккеге тикшеренүләрдә алдан әйтелгәнчә, 7,32,37 SPACA6 домен структурасы кеше IZUMO1ныкына охшаган, һәм ике протеин гадәти булмаган мотивны уртаклашалар: 4HB өчпочмаклы гелик өслеге һәм парлы диффид белән бәйләнгән CXXC мотивлары.Без IZUMO1 һәм SPACA6 хәзер гаме кушылуы белән бәйле протеиннарның зуррак, структур яктан бәйләнешле суперфамилиясен билгеләргә тәкъдим итәбез.Суперфильмга хас булган функцияләрне кулланып, без АльфаФольд структур структурасы кеше протеомы өчен тулы эзләнүләр үткәрдек, бу суперфильмның өстәмә әгъзаларын ачыкладык, шул исәптән гаме кушылуында һәм / яки ашламада катнашкан берничә әгъзаны.Хәзерге вакытта гаме кушылуы белән бәйле протеиннарның уртак структур катламы һәм күп балалы гаиләсе бар, һәм безнең структура кеше гамете кушылу механизмының бу мөһим аспектының молекуляр картасын тәкъдим итә.
SPACA6 - бер N-бәйләнгән гликан һәм алты путатив диффид бәйләнеше булган бер пассажир трансмембрана протеины (С1а һәм С2 рәсемнәр).Без Дрософила S2 күзәнәкләрендә кеше SPACA6 (калдыклар 27–246) күзәнәктән тыш доменын белдердек һәм никель якынлыгы, катион алмашу, зурлыкны чыгару хроматографиясе ярдәмендә протеинны чистарттык (С1б рәсем).Чистартылган SPACA6 эктодомейн бик тотрыклы һәм бертөрле.Күппочмаклы яктылык тарату (SEC-MALS) белән берлектә зурлыкны чыгару хроматографиясен кулланып анализ 26,2 ± 0,5 kDa исәпләнгән молекуляр авырлык белән иң югары ноктаны ачыклады (S1c рәсем).Бу SPACA6 мономерик эктодомейн зурлыгына туры килә, чистарту вакытында олигомеризациянең булмавын күрсәтә.Моннан тыш, түгәрәк дихроизм (CD) спектроскопиясе 51,3 ° C эретү ноктасы булган катнаш α / β структурасын ачты (S1d, e).CD спектрының деконволюциясе 38,6% hel-гелик һәм 15,8% β сызыклы элементларны ачыклады (С1д рәсем).
SPACA6 эктодомен очраклы матрица орлыгы ярдәмендә кристаллланган, нәтиҗәдә 2,2 resolution резолюциясе белән мәгълүматлар җыелмасы барлыкка килгән (таблица 1 һәм С3 рәсем).Структураны билгеләү өчен бромид экспозициясе белән фрагментка нигезләнгән молекуляр алмаштыру һәм SAD фазалы мәгълүматлар комбинациясен кулланып, соңгы чистартылган модель 27–246 калдыклардан тора.Структурасы билгеләнгән вакытта эксперименталь яки AlphaFold структуралары булмаган.SPACA6 эктодомейн 20 Å × 20 Å × 85 measures үлчәмендә, җиде шакмактан һәм тугыз β кылдан тора, һәм алты дезулфид бәйләнеше белән тотрыклыланган өченче кат катламы бар (1а рәсем, б).Asn243 ян чылбыры ахырындагы зәгыйфь электрон тыгызлык бу калдыкның N белән бәйләнгән гликозиляция булуын күрсәтә.Структурасы ике доменнан тора: N-терминал дүрт геликс бәйләнеше (4HB) һәм C-терминалы Ig шикелле домен, алар арасында арадаш чылбыр өлкәсе (1с рәсем).
SPACA6 күзәнәктән тыш домен структурасы.SPACA6-ның күзәнәктән тыш доменының полосасы схемасы, чылбырның төсе N-C-терминалдан куе зәңгәрдән куе кызылга кадәр.Дисульфид бәйләнешендә катнашкан цистиннар тылсымда күрсәтелә.b SPACA6ның күзәнәктән тыш домены топологиясе.Рәсем 1адагы кебек төс схемасын кулланыгыз.c SPACA6 күзәнәктән тыш домен.4HB, элмә һәм Ig шикелле домен полосасы схемалары төсле кызгылт сары, яшел һәм зәңгәр төстә.Катламнар масштабка тартылмаган.
SPACA6ның 4HB домены дүрт төп шакмакны (1–4 шеликлар) үз эченә ала, алар гелик геликс (2а рәсем) формасында урнаштырылган, антипараллель һәм параллель үзара бәйләнешләр арасында алышыналар (2б рәсем).Кечкенә өстәмә бер борылышлы геликс (геликс 1 ′) бәйләнешкә перпендикуляр итеп куела, 1 һәм 2 шакмаклары булган өчпочмакны формалаштыра. Рәсем 2а).
4HB N-терминал полосасы диаграммасы.b Дүрт шакмакның иң югары күренеше, һәр геликс N-терминуста куе зәңгәр төстә, C-терминалда куе кызыл төстә күрсәтелгән.в 4HB өчен өстән аска спираль тәгәрмәч схемасы, һәр калдык бер хәрефле аминокислота коды белән тамгаланган түгәрәк рәвешендә күрсәтелә;тәгәрмәч өстендәге дүрт аминокислоталар гына санала.Поляр булмаган калдыклар сары төстә, поляр зарядсыз калдыклар яшел төсле, уңай корылган калдыклар зәңгәр төстә, тискәре корылган калдыклар кызыл төстә.d 4HB доменының өчпочмаклы йөзләре, 4HBs кызгылт сары, яшел төстәге элгечләр.Ике керемдә таяк формасындагы диффид бәйләнешләре күрсәтелә.
4HB эчке гидрофобик үзәккә тупланган, нигездә алифатик һәм хуш исле калдыклардан (2 нче рәсем).Ядрәсе Cys41 белән Cys55 арасында диффид бәйләнешен үз эченә ала, алар өске күтәрелгән өчпочмакта 1 һәм 2 шакмакларны тоташтыралар (2 нче рәсем).Геликс 1 inдагы CXXC мотивы һәм элмә төбәгендәге hair-чәч очында табылган тагын бер CXXC мотивы арасында ике өстәмә диффид бәйләнеше барлыкка килде (2-нче рәсем).Билгесез функцияле (Arg37) консерватив аргинин калдыклары 1 ′, 1, һәм 2 шакмаклары белән ясалган буш өчпочмак эчендә урнашкан, Cβ, Cγ, Cδ Arg37 алифатик углерод атомнары гидрофобик үзәк белән үзара бәйләнештә торалар, һәм аның гуанидин төркемнәре цикллы хәрәкәт итәләр. Thr32 арка сөяге һәм ян чылбыр арасындагы үзара бәйләнеш аша 1 ′ һәм 1 шакмаклары арасында (С5а, б).Tyr34 бушлыкка сузыла, ике кечкенә куышлык калдыра, алар аша Arg37 эретүче белән үзара бәйләнештә була ала.
Иг сыман sand-сандвич доменнары - гидрофобик үзәк аша үзара бәйләнештә торган ике яки күбрәк күп полосалы амфипатик ets таблицаларның уртак үзенчәлеген уртаклашкан зур протеиннар гаиләсе, 39. C-терминалы Ig-охшаган SPACA6 домены бер үк үрнәккә ия. һәм ике катламнан тора (С6а рәсем).1 нче таблица - дүрт юлның β-таблицасы (D, F, H, һәм I), анда F, H, һәм мин анти-параллель аранжировка ясыйм, һәм I һәм D юллары параллель үзара бәйләнештә торалар.2 нче таблица - параллельгә каршы ике катлы бета таблицасы (E һәм G юллары).E чылбырының C-терминалы белән H чылбырының үзәге (Cys170-Cys226) арасында эчке диффид бәйләнеше күзәтелде (S6b рәсем).Бу дезулфид бәйләнеше иммуноглобулинның sand-сандвич доменындагы диффид бәйләнешенә тиң.
Дүрт юллы β-таблицаның бөтен озынлыгы буенча борылып, формасы һәм электростатикасы белән аерылып торган асимметрик кырлар барлыкка килә.Нечкә чите - яссы гидрофобик экологик өслек, ул SPACA6дагы калган тигез булмаган һәм электростатик төрле өслекләр белән чагыштырганда аерылып тора (С6б рәсеме, с).Гидрофобик өслекне әйләндереп алган арка сөяге карбонил / амино группалары һәм поляр ягы чылбырлары (S6c рәсем).Киңрәк маржа гидрофобик үзәкнең N-терминал өлешен блоклаучы һәм F чылбырлы арка сөягенең ачык поляр төркеме белән өч водород бәйләнешен формалаштырылган гелик сегмент белән капланган (S6d рәсем).Бу кырның C-терминалы өлеше өлешчә ачылган гидрофобик үзәкле зур кесә формалаштыра.Кесә уңай корылмалар белән әйләндереп алынган, ике аргинин калдыклары (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 һәм Arg212-Arg214) һәм үзәк гистидин (His220) (С6е рәсем).
Кальян өлкәсе - гелик домен белән Иг сыман домен арасында кыска сегмент, бер антипараллель өч катлы β катламнан (А, В һәм С), кечкенә 310 геликс һәм берничә озын очраклы гелик сегмент.(С7 рәсем).Кальян өлкәсендәге ковалент һәм электростатик контактлар челтәре 4HB һәм Ig шикелле домен арасындагы юнәлешне тотрыклыландыра.Челтәрне өч өлешкә бүлеп була.Беренче өлештә ике CXXC мотивы бар (27CXXC30 һәм 139CXXC142), алар элмәдәге hair-чәч белән 4HBдагы 1 ′ геликс арасында пар диффид бәйләнешен формалаштыралар.Икенче өлештә Иг сыман домен белән элмә арасында электростатик үзара бәйләнеш бар.Глю132 элмәдә тоз күперен формалаштыра, Ig шикелле доменда Arg233 һәм элмәдә Arg135.Өченче өлеш Иг сыман домен белән элмә өлкәсе арасында ковалент бәйләнешне үз эченә ала.Ике диффид бәйләнеше (Cys124-Cys147 һәм Cys128-Cys153) элмә әйләнешне Gln131 һәм арка сөяге функциональ төркеме арасында электростатик үзара бәйләнешләр ярдәмендә тотрыклыланган тоташтыручыга тоташтыралар, беренче Ig сыман доменга керергә мөмкинлек бирәләр.чылбыр.
SPACA6 эктодомейн структурасы һәм 4HB һәм Ig сыман доменнарның аерым структуралары 42 протеин базаларында структур охшаш язмаларны эзләү өчен кулланылды.Без югары Dali Z балллары, кечкенә стандарт тайпылышлар һәм зур LALI баллары белән матчларны ачыкладык (соңгысы структур эквивалент калдыклар саны).Тулы эктодомен эзләүдән беренче 10 хит (S1 таблицасы) кабул ителгән Z-балл> 842 булса да, 4HB яки Ig шикелле домен эзләү бу хитларның күбесенең β-сандугачларга туры килүен күрсәтте.күп протеиннарда очрый торган бөтен катлам.Далидагы өч эзләү дә бер нәтиҗәгә кайтты: IZUMO1.
Күптән SPACA6 һәм IZUMO1 структур охшашлыкларны уртаклашырга тәкъдим итәләр7,32,37.Бу ике гаме кушылу белән бәйле протеиннарның эктодомейннары 21% эзлеклелеге белән уртаклашсалар да (S8a рәсем), катлаулы дәлилләр, шул исәптән консерваланган дисулфид бәйләнеше үрнәге һәм SPACA6дагы C-терминалы Иг сыман домен, иртә төзергә тырышты. шаблон буларак IZUMO1 кулланып A SPACA6 тычканының гомология моделе37.Безнең структура бу фаразларны раслый һәм охшашлыкның чын дәрәҗәсен күрсәтә.Чынлыкта, SPACA6 һәм IZUMO137,43,44 структуралары бер үк ике домен архитектурасын бүлешәләр (С8б рәсем) охшаш 4HB һәм Иг сыман sand-сандвич доменнары белән элмә өлкәсе белән бәйләнгән (S8c рәсем).
IZUMO1 һәм SPACA6 4HB гадәти спираль бәйләнешләрдән уртак аермаларга ия.Типик 4HBлар, 45,46 эндосомаль кушылуда катнашкан SNARE белок комплексларында булган кебек, үзәк күчәр тирәсендә даими кәкрелекне саклап торучы шакмаклар тигез. тигез булмаган төрү (рәсем S8d).Борылыш, мөгаен, 1 ′, 1 һәм 2 шакмаклары белән барлыкка килгән өчпочмак аркасында килеп чыккан, IZUMO1 һәм SPACA6да саклана һәм шул ук CXXC мотивы белән 1 he геликс буенча тотрыклыландырыла.Шулай да, SPACA6 (Cys41 һәм Cys55 ковалентлы рәвештә 1 һәм 2 шакмакларны тоташтыручы) табылган өстәмә диффид бәйләнеше өчпочмакның иң очында кискен очны барлыкка китерә, SPACA6 IZUMO1 белән чагыштырганда, куышлы өчпочмаклары белән.Моннан тыш, IZUMO1 SPACA6дагы бу куышның үзәгендә күзәтелгән Arg37 җитми.Киресенчә, IZUMO1 алифатик һәм хуш исле калдыкларның типик гидрофобик үзәгенә ия.
IZUMO1 Иг сыман доменга ия, ике юллы һәм биш юллы β-таблица 43.IZUMO1дагы өстәмә чыбык SPACA6дагы кәтүкне алыштыра, ул F чыбык белән үзара бәйләнештә, аркадагы водород бәйләнешләрен чикләү өчен.Кызыклы чагыштыру ноктасы - ике протеинның Иг сыман доменнарының фаразланган өслек корылмасы.IZUMO1 өслеге SPACA6 өслегенә караганда тискәре корылма.Сперма мембранасына караган С-терминус янында өстәмә корылма урнашкан.SPACA6-да шул ук төбәкләр нейтраль яки уңай корылган (С8е рәсем).Мәсәлән, SPACA6дагы гидрофобик өслек (нечкә кырлар) һәм уңай корылган чокырлар (киң кырлар) IZUMO1да тискәре корылган.
IZUMO1 һәм SPACA6 арасындагы бәйләнеш һәм икенчел структура элементлары яхшы сакланган булсалар да, Иг сыман доменнарның структур тигезләнеше ике доменның бер-берсенә карата гомуми юнәлешендә аерылып торуларын күрсәтте (S9 рәсем).IZUMO1 спираль бәйләнеше β-сандвич турында кәкре, алда тасвирланган "бумеранг" формасын үзәк күчтән якынча 50 ° ка ясый.Киресенчә, SPACA6дагы вертикаль нур капма-каршы якка якынча 10 ° иелгән.Бу юнәлештәге аермалар, мөгаен, элмә өлкәсендәге аермалар аркасында булырга мөмкин.Беренчел эзлеклелек дәрәҗәсендә, IZUMO1 һәм SPACA6 элмәдә аз эзлеклелек охшашлыгы, цистин, гликин һәм аспарт кислотасы калдыкларын исәпкә алмаганда.Нәтиҗәдә, водород бәйләнешләре һәм электростатик челтәрләр бөтенләй башка.β-таблицаның икенчел структур элементлары IZUMO1 һәм SPACA6 белән уртак, IZUMO1 чылбырлары озынрак булса да, 310 геликс (геликс 5) SPACA6 өчен уникаль.Бу аермалар ике төрле охшаш протеиннар өчен төрле домен юнәлешләренә китерәләр.
Безнең Дали сервер эзләве ачыклады, SPACA6 һәм IZUMO1 - эксперименталь билгеләнгән ике структура, белок базасында сакланган, бу 4HB катлы (S1 таблицасы).Күптән түгел, DeepMind (Alphabet / Google) АльфаФольдны эшләде, нейрон челтәр нигезендәге система, белгечләрнең 3D структураларын төгәл эзлеклелектә алдан әйтә ала48.SPACA6 структурасын чишкәннән соң озак та үтми, AlphaFold мәгълүмат базасы чыгарылды, кеше протеомындагы барлык протеиннарның 98,5% тәшкил иткән прогнозлы структур модельләрен тәкъдим итте48,49.Эзләү моделе буларак безнең чишелгән SPACA6 структурасын кулланып, AlphaFold кеше протеомында модель өчен структур гомология эзләү SPACA6 һәм IZUMO1 белән структур охшашлыклары булган кандидатларны ачыклады.SPACA6 (рәсем. S10a) фаразлаганда АльфаФольдның искиткеч төгәллеген исәпкә алып, аеруча 1,1 мм эктодомейн безнең чишелгән структура белән чагыштырганда (S10b рәсем) - без ачыкланган SPACA6 матчларының төгәл булуына ышана алабыз.
Элегерәк, PSI-BLAST IZUMO1 кластерын сперма белән бәйле тагын өч протеин белән эзләде: IZUMO2, IZUMO3 һәм IZUMO450.АльфаФольд фаразлады, бу IZUMO гаилә протеиннары 4HB доменына IZUMO1 (3а һәм S11 рәсемнәр) белән бер үк диффид бәйләнеш үрнәге белән кушылалар, аларда Ig сыман домен булмаса да.IZUMO2 һәм IZUMO3 IZUMO1 охшаган бер яклы мембрана протеиннары дип фаразлана, IZUMO4 яшерен булып күренә.IZUMO 2, 3, һәм 4 протеинның гаме кушылуындагы функцияләре билгеләнмәгән.IZUMO3 сперматозоа үсеше вакытында акросома биогенезында роль уйный, билгеле, һәм IZUMO протеины комплекс 50 тәшкил итә.Имезүчеләрдә, сөйрәлүчеләрдә һәм амфибияләрдә IZUMO белгечләрен саклау аларның потенциаль функциясе DCST1 / 2, SOF1, FIMP кебек билгеле гаме-кушылу белән бәйле аксымнар белән туры килүен күрсәтә.
4HB, элмә, Иг сыман доменнар белән, кызгылт сары, яшел һәм зәңгәр төстә күрсәтелгән IST суперфамилиясенең домен архитектурасы схемасы.IZUMO4 кара C кебек уникаль C-терминал өлкәсенә ия.Расланган һәм путатив диффид бәйләнешләре каты һәм нокталы сызыклар белән күрсәтелә.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1), DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) A. панель белән бер үк төс диапазонында күрсәтелә.TMEM95, IZUMO2 һәм IZUMO3 трансмембрана шакмаклары күрсәтелми.
IZUMO протеиныннан аермалы буларак, башка SPACA белгечләре (ягъни, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, һәм SPACA9) структур яктан SPACA6 белән аерылып торалар дип уйланалар (S12 рәсем).SPACA9 гына 4HB бар, ләкин параллель-анти-параллель ориентация яки SPACA6 белән бер үк диффид бәйләнеше булыр дип көтелмәгән.Бары тик SPACA1 охшаш Ig доменына ия.AlphaFold SPACA3, SPACA4 һәм SPACA5 SPACA6 белән чагыштырганда бөтенләй башка структурага ия дип фаразлый.Кызык, SPACA4 шулай ук ​​ашламада роль уйный, ләкин SPACA6 белән чагыштырганда, сперма һәм ооцит зона pellucida52 арасындагы үзара бәйләнешне җиңеләйтә.
Безнең AlphaFold эзләү IZUMO1 һәм SPACA6 4HB, TMEM95 өчен тагын бер матч тапты.TMEM95, спермага хас трансмембрана протеины, 32,33 абляцияләнгәндә ир-ат тычканнарын туфраксыз итә.Сперматозоада TMEM95 булмаган нормаль морфология, хәрәкәтчәнлек, зона пеллюсидасына үтеп керү һәм йомырка мембранасына бәйләү сәләте булган, ләкин ооцит мембранасы белән кушыла алмаган.Элеккеге тикшеренүләр күрсәткәнчә, TMEM95 IZUMO133 белән структур охшашлыкларны бүлешә.Чыннан да, АльфаФольд моделе TMEM95 4HB булуын раслады, IZUMO1 һәм SPACA6 белән бер үк пар CXXC мотивлары һәм SPACA6 тапкан 1 һәм 2 шакмаклар арасында шул ук өстәмә диффид бәйләнеше (3а һәм S11 рәсем).TMEM95-та Ig сыман домен булмаса да, аның SPACA6 һәм IZUMO1 элмә өлкәләренә охшаган диффид бәйләнеш үрнәге бар (3б рәсем).Бу кулъязма бастырылган вакытта, алдан бастырылган сервер TMEM95 структурасын хәбәр итте, AlphaFold53 нәтиҗәләрен раслады.TMEM95 SPACA6 һәм IZUMO1 белән бик охшаган һәм эволюцион рәвештә амфибияләрдә сакланган (4 нче рәсем һәм S13).
PSI-BLAST эзләү NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, һәм SOF1 мәгълүмат базаларын кулланды, бу эзлеклелекнең тормыш агачындагы торышын.Филиал нокталары арасы масштабта күрсәтелми.
SPACA6 һәм IZUMO1 арасында гомуми структур охшашлык, алар TMEM95 һәм IZUMO 2, 3, һәм 4 протеинны үз эченә алган консервацияләнгән структур суперфамилия әгъзаларын табуларын күрсәтәләр.билгеле әгъзалар: IZUMO1, SPACA6 һәм TMEM95.Иг сыман доменнары булганга, IST суперфамилиянең билгесе - 4HB домены, бу протеиннарның барысына да хас булган уникаль үзенчәлекләргә ия: 1) параллель / параллель альтернативада урнаштырылган шеликлар белән 4HB күмелгән. . 5а), 2) бәйләнеш өчпочмаклы йөзгә ия, бәйләнеш эчендә ике шакмактан һәм өченче вертикаль геликс (рәсемнең төп өлкәсе (5с рәсем). Тиоредоксинга охшаган аксымнарда табылган CXXC мотивы билгеле. редокс сенсоры буларак 54,55,56, IST гаилә әгъзаларының мотивы гаме кушылуында ERp57 кебек протеин диффид изомеразалары белән бәйләнештә булырга мөмкин. Рольләр 57,58 белән бәйләнгән.
IST суперфамилия әгъзалары 4HB доменының өч характеристикасы белән билгеләнәләр: параллель һәм антипараллель ориентация арасында алышынган дүрт шакмак, ба-өчпочмаклы гелик бәйләнеш йөзләре, һәм кечкенә молекулалар арасында формалашкан CXXC икеләтә мотив.) N-терминал геликслары (кызгылт сары) һәм элмә өлкәсе hair-чәч (яшел).
SPACA6 һәм IZUMO1 арасында охшашлыкны исәпкә алып, элеккесенең IZUMO1 яки JUNO белән бәйләү сәләте сыналды.Биолаер интерферометриясе (BLI) - кинетик нигезле бәйләү ысулы, моңа кадәр IZUMO1 һәм JUNO арасындагы үзара бәйләнешне бәяләү өчен кулланылган.Биотинлы маркалы сенсорны IZUMO1 белән JUNO аналитикының югары концентрациясе булган җим итеп инкубацияләгәннән соң, көчле сигнал табылды (S14a рәсем), бу сенсор очына бәйләнгән биоматериал калынлыгының бәйләнешле үзгәрүен күрсәтә.Охшаш сигналлар (ягъни, JUNO сенсорга IZUMO1 аналитикына каршы җимлек итеп кушылды) (С14б рәсем).SPACA6 сенсор белән бәйләнгән IZUMO1 яки сенсор белән бәйләнгән JUNO каршы аналитик буларак кулланылганда бернинди сигнал табылмады (С14а рәсем, б).Бу сигналның булмавы шуны күрсәтә: SPACA6-ның күзәнәктән тыш домены IZUMO1 яки JUNOның күзәнәктән тыш домены белән үзара бәйләнештә тормый.
BLI анализы җим протеинындагы ирекле лизин калдыкларын биотиниляцияләүгә нигезләнгәнгә, бу модификация лизин калдыклары үзара бәйләнештә катнашса, бәйләүдән саклый ала.Моннан тыш, сенсорга бәйләү юнәлеше стерик киртәләр тудырырга мөмкин, шуңа күрә SPACA6, IZUMO1 һәм JUNO эктодоменнарында рекомбинантта гадәти тарту бәяләре ясалды.Шуңа да карамастан, SPACA6 аның тамгаланган IZUMO1 яки аның тамгаланган JUNO (S14c, d) белән явым-төшем ясамады, бу BLI экспериментларында күзәтелгәнгә туры килмәвен күрсәтә.Позитив контроль буларак, без JUNOның IZUMO1 дип язылган үзара бәйләнешен расладык (S14e һәм S15 рәсемнәр).
SPACA6 һәм IZUMO1 арасында структур охшашлыкка карамастан, SPACA6ның JUNO бәйли алмавы гаҗәп түгел.Кеше IZUMO1 өслегендә JUNO белән үзара бәйләнештә торган 20 дән артык калдык бар, шул исәптән өч төбәкнең һәрберсенең калдыклары (аларның күбесе элмә төбәгендә булса да) (S14f рәсем).Бу калдыкларның берсе генә SPACA6 (Glu70) сакланган.Күпчелек калдыклар оригиналь биохимик үзлекләрен саклап калсалар да, IZUMO1дагы төп Arg160 калдыклары SPACA6дагы тискәре корылган Asp148 белән алыштырылды;алдагы тикшеренүләр күрсәткәнчә, IZUMO1дагы Arg160Glu мутациясе JUNO43 белән бәйләнешне тулысынча юкка чыгара.Моннан тыш, IZUMO1 һәм SPACA6 арасындагы домен ориентациясенең аермасы SPACA6 буенча эквивалент өлкәнең JUNO бәйләүче мәйданының өслеген сизелерлек арттырды (S14g рәсем).
Гамета кушылуы өчен SPACA6 кирәклегенә һәм аның IZUMO1 белән охшашлыгына карамастан, SPACA6 эквивалент JUNO бәйләү функциясенә охшамый.Шуңа күрә без структур мәгълүматларыбызны эволюцион биология белән тәэмин ителгән мөһимлекне расларга тырыштык.SPACA6 гомологларының эзлеклелеге имезүчеләрдән тыш уртак структураны саклауны күрсәтә.Мәсәлән, цистин калдыклары хәтта ерак булган амфибияләрдә дә бар (6а рәсем).ConSurf серверын кулланып, SPACA6 өслегенә 66 эзлеклелектә берничә эзлеклелектә тигезләнү саклау мәгълүматлары ясалды.Анализның бу төре протеин эволюциясе вакытында нинди калдыкларның сакланганын күрсәтә ала һәм нинди өслек өлкәләренең функциядә роль уйный алуын күрсәтә ала.
КЛУСТАЛ ОМЕГА ярдәмендә әзерләнгән 12 төрле төрдән SPACA6 эктодоменнарының эзлеклелеге.ConSurf анализы буенча, иң консерватив позицияләр зәңгәр төстә билгеләнгән.Ystистин калдыклары кызыл төстә күрсәтелгән.Домен чикләре һәм икенчел структура элементлары тигезләү өстендә күрсәтелә, анда уклар β-кылларны күрсәтәләр, дулкыннар шакмакларны күрсәтәләр.Эзләүләрне үз эченә алган NCBI керү идентификаторлары: кеше (Homo sapiens, NP_001303901), мандрил (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), капучин маймыл (Cebus mimic, XP_017359366), ат (Equus caballus, XP_02350610 34).), сарыклар. , 61_89 һәм Bullfrog (Буфо буфо, XP_040282113).Номерлау кеше тәртибенә нигезләнгән.b SPACA6 структурасының өске өлешендә 4HB һәм аскы өлешендә Иг сыман домен, ConSurf серверыннан саклау бәяләренә нигезләнгән төсләр.Иң яхшы сакланган өлешләр зәңгәр төстә, уртача сакланган өлешләр ак төстә, ә иң аз сакланганнары сары төстә.кызгылт цистин.Protectionгары саклауны күрсәтүче өч өслек ямагы 1, 2 һәм 3 дип язылган инсетта күрсәтелә. 4HB мультфильмы уң яктагы инсетта күрсәтелә (бер үк төс схемасы).
SPACA6 структурасында өч югары сакланган өслек өлкәсе бар (6б рәсем).Пач 1 4HB һәм элмә өлкәсен үз эченә ала һәм ике консерваланган CXXC диффид күпере, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 элмә челтәре (рәсем S7), һәм сакланган тышкы хуш исле калдыклар (Phe31, Tyr73, Phe137).Сперма өслегендә берничә уңай корылган калдыкны күрсәтүче Ig сыман доменның киңрәк кыры (S6e рәсем).Кызык, бу пачта антитело эпитопы бар, моңа кадәр SPACA6 30 функциясенә комачаулаганы күрсәтелгән.Регион 3 элмә һәм Иг сыман доменның бер ягын үз эченә ала;бу төбәктә консерваланган проолиннар (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) һәм тышкы поляр / корылма калдыклары бар.Гаҗәп, 4HB өслегендәге калдыкларның күбесе бик үзгәрә (6б рәсем), гәрчә SPACA6 гомологында (гидрофобик бәйләнеш консерватизмы күрсәткәнчә) һәм IST суперфамилиядән читтә сакланган булса да.
Бу SPACA6дагы иң кечкенә ачыкланган икенчел структур элементлары булган иң кечкенә төбәк булса да, күп элмә өлкәсе калдыклары (шул исәптән 3 регион) SPACA6 гомологлары арасында бик сакланган, бу гелик бәйләнешнең һәм β-сандвичның юнәлешен күрсәтә ала.консерватор буларак.Ләкин, SPACA6 һәм IZUMO1 элмә төбәгендә водород бәйләнешенә һәм электростатик челтәрләргә карамастан, IZUMO137,43,44 рөхсәт ителгән структураларның тигезләнешендә эчке сыгылучылык дәлилләрен күрергә мөмкин.Аерым доменнарның тигезләнеше яхшы капланган, ләкин доменнарның бер-берсенә карата юнәлеше үзәк күчәреннән 50 ° - 70 ° ка үзгәргән (S16 рәсем).SPACA6 конформацион динамикасын аңлау өчен, SAXS экспериментлары үткәрелде (S17a, б).SPACA6 эктодомейнын реконструкцияләү таяк кристалл структурасына туры килде (С18 рәсем), гәрчә Кратки сюжеты ниндидер дәрәҗәдә сыгылучылык күрсәтте (S17b рәсем).Бу конформация IZUMO1 белән капма-каршы, анда чикләнмәгән протеин такталарда да, эремәләрдә дә бумеранг формасын ала.
Эчкерсез төбәкне махсус ачыклау өчен, SPACA6да водород-деутерий алмашу масса спектроскопиясе (H-DXMS) башкарылды һәм моңа кадәр IZUMO143 алынган мәгълүматлар белән чагыштырылды (7а рәсем, б).SPACA6 IZUMO1 белән чагыштырганда ачыкрак, 100,000 с алмашудан соң структура буенча югары деутерий алмашу күрсәткәнчә.Ике структурада да, элмә өлкәсенең C-терминал өлеше югары дәрәҗәдәге алмашуны күрсәтә, бу, мөгаен, 4HB һәм Ig сыман доменнарның бер-берсенә карата чикләнгән әйләнешенә мөмкинлек бирә.Кызык, 147CDLPLDCP154 калдыкларыннан торган SPACA6 элмәсенең C-терминал өлеше бик сакланган төбәк 3 (6б рәсем), бу, мөгаен, араларның сыгылмалылыгы SPACA6ның эволюцион рәвештә сакланган үзенчәлеген күрсәтә.Эчлек анализы буенча, CD җылылык эретү мәгълүматлары SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) IZUMO1 (Tm = 62,9 ° C) белән чагыштырганда тотрыклырак булуын күрсәтте (S1e һәм S19 рәсем).
SPACA6 һәм b IZUMO1 H-DXMS рәсемнәре.Деутерий алмашу күрсәтелгән вакыт пунктларында билгеләнде.Водород-деутерий алмашу дәрәҗәләре зәңгәрлектән (10%) кызылга (90%) градиент шкалада төс белән күрсәтелә.Кара тартмалар югары алмашу өлкәләрен күрсәтәләр.Кристалл структурасында күзәтелгән 4HB, элмә һәм Иг сыман домен чикләре төп эзлеклелектә күрсәтелгән.10 с, 1000 с, һәм 100,000 с деутерий алмашу дәрәҗәләре SPACA6 һәм IZUMO1ның үтә күренмәле молекуляр өслекләренә өстән ясалган полоса схемасында урнаштырылган.Деутерий алмашу дәрәҗәсе 50% тан түбән булган структураларның өлешләре ак төсле.50% H-DXMS алмашу өлкәләре градиент шкалада төсле.
CRISPR / Cas9 һәм тычкан генының ноктаут генетик стратегияләрен куллану сперма һәм йомырка бәйләү һәм кушылу өчен мөһим берничә факторны ачыклауга китерде.IZUMO1-JUNO һәм CD9 структурасының яхшы характерлы үзара бәйләнешеннән кала, гаме кушылуы белән бәйле протеиннарның күбесе структур һәм функциональ энигматик булып кала.SPACA6ның биофизик һәм структур характеристикасы - ашлама вакытында ябышу / кушылу молекуляр табышмакның тагын бер кисәге.
SPACA6 һәм IST гаиләсенең башка әгъзалары имезүчеләрдә, аерым кошларда, сөйрәлүчеләрдә һәм амфибияләрдә бик сакланган булып күренә;Чынлыкта, SPACA6 хәтта зебрафишта ашлама өчен дә кирәк дип уйланыла 59. Бу тарату DCST134, DCST234, FIMP31, SOF132 кебек гаме кушылуы белән бәйле белгечләргә охшаган, бу факторлар HAP2 җитешсезлеген күрсәтә (шулай ук) GCS1 дип аталган) күп протестларның катализатор активлыгы өчен җаваплы белгечләр., үсемлекләр, артроподлар.Орлыкландырылган кушылма протеиннары 60, 61. SPACA6 һәм IZUMO1 арасында көчле структур охшашлыкка карамастан, бу протеиннарның икесен дә кодлаучы геннар ноктасы ир-ат тычканнарында туфраксызлыкка китерде, бу аларның гамета кушылу функцияләренең кабатланмавын күрсәтә..Киңрәк итеп әйткәндә, кушылуның ябышу этабы өчен кирәк булган билгеле сперма белгечләренең берсе дә артык түгел.
Бу ачык сорау булып кала, SPACA6 (һәм IST суперфамилиянең башка әгъзалары) интергаметик тоташуларда катнашалармы, мөһим протеиннарны кушылу нокталарына җәлеп итү өчен, интергагаметик челтәрләр формалаштыралармы, яисә хәтта фузогеннар булып эш итәләрме.HEK293T күзәнәкләрендәге иммунопрекипитация тикшеренүләре тулы озынлыктагы IZUMO1 һәм SPACA632 арасында үзара бәйләнешне ачыкладылар.Ләкин, безнең рекомбинант эктодомейннар витрода үзара тәэсир итмәделәр, Нода һ.б.икесе дә конструкциядә бетерелде (IZUMO1 цитоплазмик койрыгына игътибар итегез, ул ашлама өчен кирәк түгеллеген күрсәтте62).Альтернатив рәвештә, IZUMO1 һәм / яки SPACA6 без витрода тудырмый торган махсус бәйләүче мохит таләп итә ала, мәсәлән, физиологик конкрет конфигурацияләр яки башка протеиннар булган молекуляр комплекслар (билгеле яки әле ачылмаган).IZUMO1 эктодомены сперматозоаның перивителлин киңлегендә йомыркага бәйләнешен арадаш дип саныйлар, SPACA6 эктодомейнының максаты аңлашылмый.
SPACA6 структурасы протеин-протеинның үзара бәйләнешендә катнашырга мөмкин булган берничә сакланган өслекне ачып бирә.CXXC мотивы белән янәшә урнашкан элмә төбәгенең сакланган өлешендә (югарыда күрсәтелгән Пач 1) берничә тышкы йөзле хуш исле калдыклар бар, алар еш кына биомолекулалар арасында гидрофобик һәм π-үзара бәйләнешләр белән бәйле.Иг сыман доменның киң ягы (2-регион) бик сакланган Arg һәм аның калдыклары белән уңай корылган трюк формалаштыра, һәм бу төбәккә каршы антителалар моңа кадәр 30 гаме кушылуны блоклау өчен кулланылган.Антитело сызыклы эпитопны таный 212RIRPAQLTHRGTFS225, алты аргинин калдыкларының өчесе булган һәм His220 бик сакланган.Дисфункция бу конкрет калдыкларның яки ​​бөтен төбәкнең блоклануы аркасындамы, билгеле түгел.Бу аерманың C-сандвичның C-терминалы янында урнашуы күрше сперма белгечләре белән үзара бәйләнешне күрсәтә, ләкин ооцит белгечләре белән түгел.Моннан тыш, элмә эчендә бик сыгылучан пролинга бай тангны (3-нче сайт) тоту протеин-протеинның үзара тәэсир итү урыны булырга мөмкин, яки, мөгаен, ике домен арасында сыгылманы саклап калырга мөмкин.Гендер SPACA6ның билгесез роле өчен мөһим.гаметаларның кушылуы.
SPACA6 күзәнәкләр арасындагы ябышу протеиннарының үзенчәлекләренә ия, шул исәптән Иг сыман сандвичлар.Күпчелек ябыштыргыч протеиннар (мәсәлән, кадериннар, интегиннар, ябыштыргычлар, һәм IZUMO1) бер яки берничә β-сандвич доменына ия, алар күзәнәк мембранасыннан аксымнарны экологик максатларына кадәр киңәйтәләр63,64,65.SPACA6-ның Ig сыман домены шулай ук ​​ябышу һәм кушылуның sand-сандугачларында очрый торган мотивны үз эченә ала: механик кыскычлар дип аталган sand-сандвич очларында параллель полосаларның икеләтә.Бу мотив кырлар арасындагы үзара бәйләнештә катнашучы протеиннар өчен кыйммәтле кыру көчләренә каршы торуны көчәйтә дип санала.Ләкин, ябыштыргычларга охшашлыгына карамастан, хәзерге вакытта SPACA6ның йомырка агы белән үзара бәйләнешенә бернинди дәлил дә юк.SPACA6 эктодомейн JUNO белән бәйләнә алмый, һәм SPACA6 экспрессив HEK293T күзәнәкләре, монда күрсәтелгәнчә, 32 зона булмаган ооцитлар белән үзара бәйләнештә тормый.Әгәр дә SPACA6 интергаметик бәйләнешләр урнаштырса, бу үзара бәйләнешләр тәрҗемәдән соң үзгәртүләр яки башка сперма белгечләре тарафыннан тотрыклыландыруны таләп итә ала.Соңгы гипотезаны хуплап, IZUMO1 дефицитлы сперматозоа ооцитларга бәйләнә, 27-нче гаметка ябышу адымында IZUMO1дан башка молекулаларның катнашуын күрсәтә.
Күпчелек вируслы, кәрәзле һәм үсеш кушылмасы протеиннары фузоген булып эшләвен фаразлаучы үзенчәлекләргә ия.Мәсәлән, вируслы кушылу гликопротеиннары (I, II һәм III класслар) гидрофобик кушылу пептиды яки хуҗа мембранасына кертелгән аксым ахырында цикл бар.IZUMO143 гидрофилик картасы һәм IST күп балалы гаилә структурасы (билгеләнгән һәм фаразланган) гидрофобик кушылу пептидын күрсәтмәде.Шулай итеп, IST суперфамилиядәге теләсә нинди протеин фузоген булып эшләсә, алар моны бүтән билгеле мисаллардан аермалы итеп эшлиләр.
Ахырда, гаме кушылуы белән бәйле аксымнарның IST әгъзаларының функцияләре тантальләштерүче сер булып кала.Безнең характерлы SPACA6 рекомбинант молекуласы һәм аның чишелгән структурасы бу уртак структуралар арасындагы бәйләнешне һәм гаметаны бәйләүдә һәм кушылуда аларның ролен аңларга ярдәм итәчәк.
Кеше фаразланган SPACA6 эктодомейнына туры килгән ДНК эзлеклелеге (NCBI кушылу номеры NP_001303901.1; калдыклар 27–246) Дрософила меланогастер S2 күзәнәкләрендә чагылдыру өчен код-оптимизацияләнде һәм Козак (Еврофинс Геномика) эзлеклелеге белән ген фрагменты буларак синтезланды., BiP сигриясе сигналы һәм тиешле 5 ′ һәм 3 ′ бу генны pMT экспрессор векторына бәйләүдән бәйсез клонлаштыру өчен бетә, пуромицин (pMT-puro) белән сайлау өчен үзгәртелгән металлотионин промоутеры нигезендә.PMT-пуро векторы тромбин ярылу урынын кодлый, аннары 10х-Аның C-терминалы (рәсем S2).
SPACA6 pMT-пуро векторын D. melanogaster S2 (Gibco) күзәнәкләренә тотрыклы күчерү IZUMO1 һәм JUNO43 өчен кулланылган протоколга охшаш башкарылды.S2 күзәнәкләре эрелгән һәм Шнайдер уртада (Gibco) үскән, 10% (v / v) җылылык-инактив булмаган фетал бозау серумы (Gibco) һәм 1X антимикотик антибиотик (Gibco) белән тулыландырылган.Иртә узу күзәнәкләре (3.0 х 106 күзәнәк) 6 кое тәлинкәләрнең аерым скважиналарында капланган (Corning).24 сәг.Күчерелгән күзәнәкләр 72 сәгать инкубацияләнде, аннары 6 мг / мл пуромицин белән җыеп алындылар.Соңыннан күзәнәкләр тулы Шнайдерның уртачасыннан изоляцияләнделәр һәм зур күләмле аксым җитештерү өчен зарарсыз Бөҗәк-XPRESS уртага (Лонза) урнаштырылды.S2 күзәнәк культурасының 1 L партиясе 2 L вентиляцияләнгән яссы полипропилен Эрленмейер флассасында 8-10 × 106 мл-1 күзәнәккә кадәр үстерелде, аннары 500 µM CuSO4 (Миллипор Сигма) концентрациясе белән стерилизацияләнде һәм стериль фильтрланды.этәргеч.Дүрт көн дәвамында 120 минутта 27 ° C температурада инкубацияләнде.
SPACA6 булган шартлы уртача центрифугация белән 5660 × г 4 ° C ка изоляцияләнде, аннары 10 kDa MWCO мембранасы булган Centramate тангеналь агым фильтрлау системасы (Pall Corp).2 мл Ni-NTA агароза резинасы (Киаген) баганасына SPACA6 булган концентрацияләнгән урта кулланыгыз.Ni-NTA резинасы 10 багана томы (CV) белән буфер белән юылган, аннары 50 мм соңгы имидазол концентрациясен бирү өчен 1 CV буфер кушылды.SPACA6 10 мл буфер белән ясалды, имидазол белән 500 мм концентрациясенә тулыландырылды.Чикләү класс тромбины (Миллипор Сигма) турыдан-туры диализ торбасына (MWCO 12-14 kDa) кушылды, 1 мг SPACA6 vs. 1 L 10 мм Tris-HCl, pH 7.5 һәм 150 мм NaCl (буфер В) диализ өчен.) 48 ° C өчен 4 ° C.Тромбин белән ярылган SPACA6 аннары тоз концентрациясен киметү өчен өч тапкыр эретелде һәм 10 мм Tris-HCl, pH 7.5 белән тигезләнгән 1 мл MonoS 5/50 GL катион алмашу баганасына (Cytiva / GE) йөкләнде.Кион алмаштыргыч 3 ОК 10 мм Tris-HCl, pH 7.5 белән юылган, аннары SPACA6 сызыклы градиент белән 0 ммнан 500 мм NaClга кадәр 10 мм Tris-HCl, pH 7.5 өчен 25 ОК өчен юылган.Ион алмашу хроматографиясеннән соң, SPACA6 1 млга тупланган һәм изократик рәвештә EN6 SEC650 10 x 300 баганасыннан (BioRad) B буферы белән тигезләнгән. Хроматограмма, бассейн һәм SPACA6 булган концентрат фракцияләр буенча.Чисталык 16% SDS-полиакриламид гелендә Coomassie-буялган электрофорез белән идарә ителде.Протеин концентрациясе Сыра-Ламберт законы һәм теоретик моляр юкка чыгу коэффициентын кулланып 280 нм тизлектә үзләштерү белән бәяләнде.
Чистартылган SPACA6 төнлә 10 мм натрий фосфатына, pH 7.4 һәм 150 мм NaF каршы диализланган һәм CD спектроскопиясе анализы алдыннан 0,16 мг / млга эретелгән.185 - 260 нм дулкын озынлыгы булган CD-ларны спектраль сканерлау Jasco J-1500 спектрополариметрында 1 мм оптик юл озынлыгы (Гельма) 25 нм / минутта 25 ° C температурада кварц куветлары ярдәмендә җыелган.CD спектры база төзәтелде, уртача 10дан артык сатып алу, һәм см2 / дмол градусында калдык эллиптикасына (θMRE) үзгәртелде:
монда MW - Daдагы һәр үрнәкнең молекуляр авырлыгы;N - аминокислоталар саны;mill миллидиграларда эллиптика;г смдагы оптик юл озынлыгына туры килә;берәмлекләрдә протеин концентрациясе.