347 12,7 * 1,24 мм Датсыз корыч күмелгән торбалар, синхрон электростатик конденсациянең молекуляр механизмы һәм α-синуклеин һәм тау коагрегациясе.

Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт.Сез чикләнгән CSS ярдәме белән браузер версиясен кулланасыз.Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та туры килү режимын сүндерегез).Моннан тыш, дәвамлы ярдәмне тәэмин итү өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәбез.
Слайдка өч мәкалә күрсәтүче слайдерлар.Слайдлар аша хәрәкәт итү өчен арткы һәм киләсе төймәләрне кулланыгыз, яки һәр слайд аша хәрәкәт итү өчен ахырдагы слайд контроллер төймәләрен кулланыгыз.

347 Датсыз корыч торба спецификациясе

347 12,7 * 1,24 мм Дат басмас корычтан торбалар

Тышкы диаметр: 6,00 мм ОД 914,4 мм ОД, 24 гә кадәр размерлар.

SS 347 торба калынлыгы диапазоны: 0,3 мм - 50 мм, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S һ.б. (0,5-12 мм) Яисә кирәк булмаганча регуляр булмаган зурлык.

Төре: SS 347 Чиксез торбалар |SS 347 ERW торбалар |SS 347 эретелгән торбалар |SS 347 җитештерелгән торбалар |SS 347 CDW трубалары, LSAW торбалар / тегү белән эретелгән / яңадан ясалган

Форма: SS 347 түгәрәк торбалар / трубалар, SS 347 квадрат торбалар / трубалар, SS 347 турыпочмаклы торба / трубалар, SS 347 күмелгән трубалар, SS 347 "U" формасы, SS 347 пан торт кәтүкләре, SS 347 Гидротехник трубалар.

Озынлык: Бер очраклы, икеләтә очраклы һәм кирәкле озынлык ахыры: Тигез бетү, Киселгән Ахыр, Аяклы

Ахырдан саклау: Пластик капкалар |Тыштан бетү: 2Б, .44, .11, .8 Датсыз корыч торбалар өчен көзге бетү, клиент таләпләре буенча тәмамлау

Тапшыру торышы: ябыштырылган һәм ашатылган, чистартылган, якты янган, салкын сызылган

Инспекция, тест отчетлары: тегермән сынау сертификатлары, EN 10204 3.1, химик отчетлар, механик отчетлар, PMI тест отчетлары, визуаль инспекция отчетлары, өченче як инспекция отчетлары, NABL расланган лаборатория отчетлары, җимергеч тест отчетлары, җимергеч тест отчетлары.

Урлау: Агач тартмаларга, пластик капчыкларга, корыч полосаларга бәйләнгән, яки клиентлар соравы буенча.

Белгечләр: aboveгарыдан башка зурлыклар һәм спецификацияләр сорау буенча җитештерелергә мөмкин

SS 347 торба размеры: 1/2 дюйм NB, OD - 24 дюйм

ASTM A312 347: temperatureгары температура һәм гомуми коррозицион хезмәт өчен эшләнгән тотрыксыз һәм туры тегелгән эретеп ябыштырылган остенитик торба.Эретеп ябыштыру вакытында тутыргыч металл рөхсәт ителми.

ASTM A358 347: Коррозив һәм / яки югары температурада хезмәт күрсәтү өчен электр кушылмасы остенитик торбаны эретте.Бу спецификациягә гадәттә 8 дюймга кадәр торба гына җитештерелә.Эретеп ябыштыру вакытында тутыргыч металл өстәргә рөхсәт ителә.

ASTM A790 347: Гомуми коррозицион хезмәт өчен эшләнгән, стресс коррозиясенең яракларына каршы торуга аеруча басым ясап, туры һәм туры тегелгән эретелгән феррит / остенитик (дуплекс) торба.

ASTM A409 347: Туры тегү яки спираль-тегү электр кушылмасы эре диаметрлы остенитик якты дивар торбасы 14 "30" зурлыктагы коррозив һәм / яки биек өчен Sch5S һәм Sch 10S диварлары белән эретелгән.

ASTM A376 347: temperatureгары температураны куллану өчен тотрыксыз остенитик торба.

ASTM A813 347: temperatureгары температура һәм гомуми коррозив кушымталар өчен бер тегү, бер яки ике эретеп ябыштырылган остенитик торба.

ASTM A814 347: temperatureгары температура һәм гомуми коррозив хезмәт өчен салкын эшләнгән эретеп ябыштырылган остенитик торба.

347H Датсыз корыч торбалар химик состав

Датсыз корыч 347H торба механик үзлекләре

Датсыз корыч 347H торбалар физик үзлекләр

347H Датсыз Корыч торба өчен эквивалент класслар

Амилоид альфа-синуклеин (αS) агрегаты Паркинсон авыруының һәм башка синуклеинопатиянең билгесе.Күптән түгел Альцгеймер авыруы белән бәйле булган тау протеины αS патологиясе белән бәйләнештә булды һәм αS бай инклюзиядә уртак локализацияләнде, гәрчә ике протеинның коагреграцияләү молекуляр механизмы аңлашылмый кала.Без монда хәбәр итәбез, phaseS фазасы сыек конденсатларга электростатик катлаулы конденсация аша тау кебек уңай корылган полипептидлар белән аерыла.Поликация өчен αSның якынлыгына һәм коагуляция челтәренең валентларның бетү тизлегенә карап, ешлык тиз тиз геляцияләнә яки аксыл амилоид агрегаты уза.Алга киткән биофизик техника комплектын берләштереп, без сыек-сыек αS / Tau фазасын аеруны характерлый алдык һәм сыек белок конденсатында ике протеин булган гетероген агрегатлар барлыкка китерүче төп факторларны ачыкладык.
Мембрана бүлекчәләренә өстәп, күзәнәкләрдә киңлек аерылуы шулай ук ​​протеинга бай, сыеклыкка охшаган тыгыз организмнар, биомолекуляр конденсатлар яки тамчылар дип аталган, сыек-сыек фазаны аеру (LLPS) процессы аша ирешеп була.Бу тамчылар күптөрле вакытлыча үзара бәйләнештә барлыкка килә, гадәттә протеиннар яки протеиннар һәм РНК арасында, һәм барлык тере системаларда диярлек төрле функцияләргә хезмәт итәләр.Күп санлы LLP сәләтле протеиннар түбән катлаулылык эзлеклелеген күрсәтәләр, алар табигатьтә һәм биомолекуляр конденсатлар формалашуда 3,4,5.Күпсанлы эксперименталь тикшеренүләр бу сыеклыкка охшаган конденсатларны тәшкил иткән протеиннарның сыгылучан, еш тәртипсез һәм күптөрле табигатен ачтылар, гәрчә бу конденсатларның үсүен һәм җитүен контрольдә тотучы молекуляр детерминантлар турында аз билгеле булса да. дәүләт..
Яңа мәгълүматлар протеин белән идарә итүче LLPS һәм тамчыларның каты структураларга әверелүе гипотезаны хуплый, кәрәзле юллар булырга мөмкин, алар еш кына дегератив авырулар билгеләре булган эри торган агулы агрегатлар барлыкка китерә.Күпчелек LLPS белән бәйле эчке тәртип бозылган аксымнар (IDP), еш кына бик зарядлы һәм сыгылмалы, күптәннән амилоид агрегаты процессы аша нейродженерация белән бәйле.Аерым алганда, FUS7 яки TDP-438 кебек биомолекуляр IDP конденсатлары яки hnRNPA19 кебек зур катлаулы доменнары булган аксымнар сыеклык дип аталган процесс аша гел шикелле яки хәтта каты формаларда картайганнар.кушылма.каты фазага күчү (LSPT) вакыт функциясе яки тәрҗемәдән соңгы модификацияләргә яки патологик әһәмияткә ия мутацияләргә җавап итеп1,7.
Vivo LLPS белән бәйләнгән тагын бер IDP - Тау, микротубул белән бәйле тәртипсез протеин, аның амилоид агрегаты Альцгеймер авыруында катнашкан, ләкин күптән түгел Паркинсон авыруында (ПД) һәм 11, 12, 13 синаптик атом протеинопатиясе белән бәйле.Тау уңайлы электростатик үзара бәйләнеш аркасында эремә / цитоплазмадан үзеннән-үзе аерылуы күрсәтелде14, нәтиҗәдә электростатик коакерватлар дип аталган тау белән баетылган тамчылар барлыкка килде.Моннан тыш, бу төр специфик булмаган үзара бәйләнеш табигатьтә күп биомолекуляр конденсатлар өчен этәргеч көче булып тора15.Тау протеины булган очракта, электростатик агрегат гади агрегат ярдәмендә барлыкка килергә мөмкин, анда протеинның капма-каршы корылган өлкәләре ярылу процессын башлый, яки РНК кебек тискәре корылган полимерлар белән үзара бәйләнештә катлаулы агрегат ярдәмендә.
Күптән түгел, PD-синуклеин (αS), ПД һәм башка нейродженератив авыруларда катнашкан амилоид IDP, синуклеинопатия 17,18 дип аталган, кәрәзле һәм хайван модельләрендә 19,20 сыеклык сыман тотышлы протеин конденсатларында тупланган.Витро тикшеренүләре күрсәткәнчә, αS гидрофобик үзара бәйләнешләр аша гади агрегат ярдәмендә LLPS кичерә, ләкин бу процесс бик югары протеин концентрацияләрен һәм атипик озын инкубация вакытларын таләп итә19,21.Вивода күзәтелгән αS булган конденсатлар теге яки бу LLPS процесслары белән формалашканмы, төп чишелмәгән проблема булып кала.Нәкъ шулай ук, PDS һәм башка синуклеинопатиядәге нейроннарда αS амилоид агрегаты күзәтелсә дә, αS күзәнәкләр эчендәге амилоид агрегатының төгәл механизмы аңлашылмый кала, чөнки бу протеинның чиктән тыш кысылуы бу процессны башлап җибәрми.Өстәмә кәрәзле зыян еш таләп ителә, күзәнәкләрдәге αS амилоид ассамблеяларын яңарту өчен кайбер кәрәзле урыннар яки микроэнергетика кирәк.Бигрәк тә агрегатка омтылучы бер кәрәзле мохит 23 протеин конденсатының эчке өлеше булырга мөмкин.
Кызык, ParkS һәм tau Паркинсон авыруы һәм башка синуклеинопатия белән кешеләрдә характерлы авырулар кертүдә 24,25 уртак локализацияләү табылды һәм экспериментлар ике белок арасында синергистик патологик бәйләнеш турында хәбәр иттеләр, 26,27 агрегат арасында потенциаль бәйләнешне күрсәтәләр. нейродженератив авыруларда.авыру.αS һәм tau үзара бәйләнештә һәм витрода һәм вивода 28,29 бер-берсенең агрегатларын алга этәрү өчен табылды, һәм бу ике протеиннан торган гетероген агрегатлар 30 синуклеинопатия белән авыручыларның баш миендә күзәтелде.Ләкин, αS һәм тау арасындагы үзара бәйләнешнең молекуляр нигезе һәм аны бергә туплау механизмы турында аз билгеле.αS тау белән үзара тәэсир итә, югары тискәре корылган C-терминал өлкәсе һәм үзәк проолга бай тау өлкәсе арасында электростатик тарту аша үзара бәйләнештә торуы, ул шулай ук ​​уңай корылган калдыклар белән баетылган.
Бу тикшеренүдә без күрсәтәбез, αS чыннан да тау протеины булганда электростатик катлаулы конденсация аша тамчыларга аерыла ала, поли-Л-лизин (pLK) кебек уңай корылган полипептидлар белән үзара тәэсиреннән аермалы буларак, һәм бу процесста.αS тамчы челтәре өчен скафольд молекуласы ролен башкара.Электростатик αS коакерватларның өлгерү процессында сизелерлек аермаларны ачыкладык, алар коакерват челтәрендә катнашкан аксымнарның үзара тәэсир итү көченең аермасы белән бәйле.Кызык, без озын гомерле сыек коакерватларда αS һәм тау амилоид аксымнарының берләшүен күзәттек һәм мондый коакерватларда бу ике протеинның берләшүенә китергән кайбер төп факторларны ачыкладык.Монда без бу процессны җентекләп тасвирлыйбыз, бу мөмкин булган молекуляр механизм, авыруга хас булган ике протеинның колокализациясе нигезендә.
neutralS нейтраль рНда югары анионик C-терминал койрыгына ия (1а рәсем), һәм без полипацион бозылган полипептид молекулалары белән электростатик комплекслар конденсациясе аша LLPS кичерергә мөмкин дип фаразладык.Нейтраль pH 32-дә уңай корылган һәм тәртипсез полимер табигате аркасында 100 калдыклы поли-Л-лизин (pLK) башлангыч модель молекуласы итеп кулландык. Беренчедән, pLK NMS спектроскопиясе чишелеше аша αS Ct домены белән үзара бәйләнештә булуын расладык. (1б рәсем) 13C / 15N маркалы αS кулланып αS артканда αS: pLK моляр катнашлары.PLK-ның Ct-домены белән үзара тәэсире химик сменаның пертурбацияләрендә һәм протеинның бу төбәгендә иң югары интенсивлыкның кимүендә күрсәтелә.Кызык, без αSны pLK белән αS концентрациясендә кушканда.Полиэтилен гликол булганда 5–25 µM (5-15% PEG-8) (типик LLPS буферы: 10 мм HEPES pH 7.4, 100 мм NaCl, 15% PEG-8) без шунда ук протеин формалашуның киң өлкәсен үттек. .тамчылар флюоресенция (WF) һәм якты кыр (BF) микроскопиясе ярдәмендә күзәтелде (1с рәсем).Концентрацияләнгән αS булган 1-5 мм тамчылары (1 µM AlexaFluor488 маркалы αS, AF488-αS кушылды), аларның электростатик үзлекләре 10% 1,6-гексанедиолга (1,6-HD) каршы торуыннан һәм аның сизгерлегеннән алынган булырга мөмкин. NaCl концентрациясенең артуы (1с рәсем).SS / pLK электростатик комплекс коакерватларының сыеклыкка охшаган табигате миллисекунд эчендә кушылу сәләте белән күрсәтелә (1-нче рәсем).Турбидиметрия кулланып, без бу шартларда тамчыларның формалашуын санадык, аның тотрыклылыгы белән бәйле төп үзара бәйләнешнең электростатик табигатен расладык (1-нче рәсем), һәм төрле полимер катнашларының LLPS процессына тәэсирен бәяләдек (1ф рәсем).Тамчы формалашуы полимер катнашларының киң спектрында күзәтелсә дә, pLK αS артык булганда процесс бик уңайлы.LLPлар шулай ук ​​химик яктан төрле күчергеч агент декстран-70 (70 kDa) яки төрле үрнәк форматлар куллану күзәтелә, шул исәптән пыяла слайд тамчылары, төрле материалларның микроплат скважиналары, Эппендорф яки кварц капиллярлары.
Бу тикшеренүдә кулланылган WT-αS һәм ΔCt-αS вариантларында төрле протеин өлкәләренең схематик чагылышы.Амфипатик N-терминал домены, гидрофобик амилоид формалаштыручы (NAC) өлкәсе һәм тискәре корылган C-терминал домены зәңгәр, кызгылт сары һәм кызыл төстә күрсәтелә.WT-αS калдыклары өчен чиста заряд (NCPR) картасы күрсәтелгән.b Макромолекуляр чүплекләр булмаганда αS / pLK үзара бәйләнешкә NMR анализы.PLK концентрациясе арта барган саен (αS: pLK моляр катнашлары 1: 0,5, 1: 1,5, һәм 1:10 ачык яшел, яшел һәм куе яшел төстә күрсәтелә).c Coacervate αS / pLK (моляр коэффициент 1:10) 25 µM (1 µM AF488 маркалы αS яки WF тасвирлау өчен Atto647N маркалы pLK) LLPS буферында (өстә) яки 500 мм NaCl (аста сулда) яки 10дан соң тулыландырылган % 1,6-гексанедиол (1,6-HD; астагы уңда).Масштаб сызыгы = 20 мм.d 25 μM концентрациясендә αS / pLK (моляр коэффициенты 1:10) BF тамчы кушылуының микроскопик рәсемнәре;уклар аерым тамчыларның (кызыл һәм сары уклар) яңа тамчыга (кызгылт сары) 200 мс эчендә кушылуын күрсәтәләр.Масштаб сызыгы = 20 мм.e Якты таралу (350 нм тирәсендә) LLS буферында αS / pLK агрегаты 500 мм NaCl кушылганнан соң һәм 25 µM αSда 10% 1,6-HD (N = 3 үрнәге кабатлана, урта һәм стандарт тайпылыш шулай ук ​​күрсәтелә).f BF образы (өстә) һәм җиңел таралу анализы (350 нм, аста) αS / pLK агрегатының 25 μM αS артуы белән αS: pLK моляр коэффициенты (N = 3 үрнәге кабатлана, урта һәм стандарт тайпылыш шулай ук ​​күрсәтелә).Масштаб сызыгы = 10 мм.Бер рәсемдәге масштаблы сызык бер панельдәге барлык рәсемнәрнең масштабын күрсәтә.Чимал мәгълүмат чимал файллары формасында бирелә.
SS / pLK электростатик комплекслы конденсацияләрне һәм tau / RNA конденсатының клиент молекуласы буларак тау31 белән турыдан-туры үзара бәйләнештә күзәтүләребезгә нигезләнеп, без αS һәм tau РНК булмаганда эретүче белән аерыла ала дип фаразладык. конденсация.электростатик комплекслар аша, һәм αS - αS / Tau коакерватларында скафолд протеины (2-нче рәсемдә тау корылмасы таратуны карагыз).10 μM αS һәм 10 μM Tau441 (1 μM AF488-αS һәм 1 μM Atto647N-Tau булган) LLPS буферында бергә кушылгач, алар WF микроскопиясе күрсәткәнчә, ике протеин булган протеин агрегатларын җиңел формалаштырдылар.(2а рәсем).Тамчыдагы ике протеинның колокализациясе конокаль (CF) микроскопия белән расланды (өстәмә рәсем 1а).Охшаш тәртип декстран-70 агрегат агенты буларак кулланылганда күзәтелә (өстәмә рәсем 1с).FITC маркалы PEG яки декстран кулланып, без җыелган агентларның икесе дә үрнәкләр буенча тигез бүленгәнен ачыкладык, сегрегацияне дә, ассоциацияне дә күрсәтмәделәр (өстәмә рәсем 1д).Киресенчә, бу системада алар макромолекуляр күпләп эффектлар аша фазаны аерырга ярдәм итәләр, чөнки PEG башка LLP системаларында күренгәнчә, тотрыклы тотрыклы халык агенты.Протеинга бай тамчылар NaCl (1 M) өчен сизгер булганнар, ләкин 1,6-HD (10% v / v) түгел, аларның электростатик үзлекләрен раслыйлар (өстәмә рәсем 2а, б).Аларның сыеклык тәртибе BF микроскопиясе ярдәмендә тамчы вакыйгаларын миллисекунд кушылуны күзәтеп расланды (2б рәсем).
LLPS буферында αS / Tau441 коакерватларының Конфокаль (CF) микроскопия рәсемнәре (һәр протеинның 10 μM, AF488 маркалы 0,5 μM һәм Atto647N маркалы Tau441).b αS / Tau441 тамчы кушылу вакыйгаларының дифференциаль интерфейс контрасты (DIC) образлары (һәр протеин өчен 10 μM).в Фаза схемасы Tau441 LLPS (0-15 µM) яктылык таралуга нигезләнгән (0-15 µM) 50 µM αS булмаганда (сулда) яки булганда (уңда).Armылы төсләр таралуны күрсәтәләр.d αS концентрациясен арттыру белән αS / Tau441 LLPS үрнәкләрен җиңел тарату (Tau441 5 µM, N = 2-3 үрнәк кабатлау).e Бу тикшерүдә кулланылган протеинның кайбер вариантларының схематик чагылышы: тискәре корылган N-терминал домены (кызыл), пролинга бай төбәк (зәңгәр), микротубул бәйләүче домен (MTBD, кызгылт сары белән күрсәтелгән), һәм амилоид формалаштыручы пар спиралы.MTBD (соры) эчендә урнашкан филамент өлкәләре (PHF).Tau441 калдыклары өчен чиста заряд (NCPR) картасы күрсәтелгән.f 1 µM AF488 маркалы αS һәм Atto647N маркалы ΔNt- куллану, 1 µM AF488 маркалы αS яки ΔCt-αS кулланып ΔNt-Tau (өскә, аксымга 10 µM) яки K18 (аста, протеинга 50 µM) ))) LLPS яки K18 буферында конденсацияләнгән WF микрографлары.Бер рәсемдәге масштаблы барлар бер панельдәге барлык рәсемнәрнең масштабын күрсәтәләр (a, b һәм f панельләр өчен 20 µm).C һәм d панельләр өчен чимал мәгълүмат чимал файллары буларак бирелә.
Бу LLPS процессында αS ролен сынап карау өчен, без иң элек NaCl концентрацияләрен кулланып нефелометрия ярдәмендә тамчы тотрыклылыгына тәэсирен тикшердек (2 нче рәсем).SS булган үрнәкләрдә тоз концентрациясе никадәр югары булса, яктылыкның таралу кыйммәтләре (350 нм), бу LLPS системасында αSның тотрыклы ролен күрсәтә.Шундый ук эффект αS концентрациясен (һәм шуннан αS: Tau441 нисбәтен) арттырып күзәтергә мөмкин.Тау концентрациясенә караганда 10 тапкыр арту (5 µМ) (2д рәсем).CoS коакерватларда скафолд протеины булуын күрсәтү өчен, без LLPS-бозылган Тау мутанты тәртибен тикшерергә булдык, тискәре корылган N-терминал өлкәсе булмаган (калдыклар 1–150, рәсемне карагыз 2e) ΔNt-Tau.WF микроскопиясе һәм нефелометрия раслады, tNt-Tau үзе LLPS (2-нче рәсем һәм өстәмә рәсем 2d) кичермәгән, алдан хәбәр ителгәнчә 14. Ләкин, бу киселгән Tau вариантының дисперсия чишелешләренә αS кушылгач, LLPS процессы тулысынча булган. Тау һәм αS охшаш шартларда һәм протеин концентрацияләрендә тулы зурлыктагы эремәләрнең тамчы тыгызлыгына якын тамчы тыгызлыгы белән торгызылды.Бу процесс шулай ук ​​аз макромолекуляр җыелу шартларында күзәтелергә мөмкин (өстәмә рәсем 2с).C-терминал αS төбәгенең роле, ләкин аның озынлыгы түгел, LLPS процессында тамчы формалашуны тыю белән күрсәтелде, C-терминал киселгән αS вариантын кулланып, 104-140 калдыклары булмаган (1а рәсем) (ΔCt- αS) протеин (2ф рәсем һәм өстәмә рәсем 2d).SS һәм tNt-Tau колокализациясе конокаль флуоресцент микроскопия белән расланды (өстәмә рәсем 1б).
Tau441 һәм αS арасында LLPS механизмын тагын да сынап карау өчен, өстәмә Tau варианты кулланылды, ягъни микротубул бәйләүче домендагы парлы гелик филамент үзәге (MTFD), ул дүрт характерлы кабатлау домены булса, гадәттә билгеле. K18 фрагменты буларак (2 нче рәсемне кара).Күптән түгел хәбәр ителгәнчә, αS микротубул бәйләүче домен алдыннан эзлеклелектә проолга бай доменда урнашкан тау протеинына өстенлек бирә.Ләкин, PHF өлкәсе уңай корылган калдыкларга да бай (2-нче рәсемне кара), аеруча лизин (15% калдык), бу безгә бу төбәкнең αS / Tau комплексының конденсациясенә өлеш кертүен тикшерергә этәрде.Тикшерелгән шартларда K18 гына 100 μM га кадәр концентрацияләрдә LLPS җибәрә алмый (15% PEG яки 20% декстранлы LLPS буфер) (2ф рәсем).Ләкин, без 50 µM KS 50 µM K18 өстәгәндә, K18 һәм αS булган аксым тамчыларының тиз формалашуы нефелометрия (өстәмә рәсем 2d) һәм WF микроскопиясе белән күзәтелде (2ф рәсем).Көтелгәнчә, ΔCt-αS K18 LLPS тәртибен торгыза алмады (2 нче рәсем).Игътибар итәбез, αS / ΔNt-Tau яки αS / Tau441 белән чагыштырганда LLPS җибәрү өчен αS / K18 агрегаты бераз югарырак протеин концентрацияләрен таләп итә, башка әйберләр тигез.Бу αS C-терминал өлкәсенең проолинга бай Тау домены белән микротубул бәйләүче домен белән чагыштырганда көчлерәк тәэсир итүенә туры килә, алда әйтелгәнчә.
TNt-Tau LLS булмаганда LLPS башкара алмавын истә тотып, без бу Tau вариантын тулы озынлыктагы Tau белән LLPS системаларында гадилеген исәпкә алып αS / Tau LLPS характеристика моделе итеп сайладык (изотип, Tau441 / Tau441).катлаулы (гетеротипик, αS / Tau441) агрегат процесслары белән.Без αS / Tau һәм αS / ΔNt-Tau системаларында αS агрегат дәрәҗәсен (конденсацияләнгән фаза протеины, fαS, c) чагыштырдык, бик охшаш кыйммәтләр таптык. Бер үк концентрациядәге барлык протеиннар өчен.Аерым алганда, без αS / Tau һәм αS / ΔNt-Tau өчен fαS, c 84 ± 2% һәм 79 ± 7% алдык, бу αS һәм tau арасындагы гетеротипик тәэсирнең тау молекулалары арасындагы үзара бәйләнештән өстен булуын күрсәтә.арасында.
Төрле поликацияләр белән үзара бәйләнеш һәм конденсация процессының αS кинетикасына тәэсире беренче тапкыр фотоблечинг (FRAP) ысулы белән флуоресцент торгызу белән өйрәнелде.Без αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau һәм αS / pLK коакерватларын сынадык (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS һәм 100 μM Tau441 яки ΔNt-Tau яки 1 mM pLK).Мәгълүмат үрнәк компонентларын кушканнан соң беренче 30 минут эчендә алынган.Вәкил ФРАП рәсемнәреннән (3а рәсем, αS / Tau441 конденсациясе) һәм аларның туры килү курслары (3б рәсем, өстәмә рәсем 3), αS кинетикасының Tau441 коакерватлары белән бик охшаганын күреп була.һәм tNt-Tau, pLK белән күпкә тизрәк.ФРАП буенча коакерват эчендә αS өчен исәпләнгән диффузия коэффициентлары (Канг һәм башкалар сурәтләгәнчә) D = 0.013 ± 0,009 µm2 / s һәм D = 0.026 ± 0,008 µm2 / s αS / Tau441 һәм αS / ΔNt- өчен αS / системасы.pLK, Tau, һәм D = 0.18 ± 0.04 µm2 / s (3 нче рәсем).Ләкин, таралган этапта αS диффузия коэффициенты барлык конденсацияләнгән фазаларга караганда зуррак зурлыктагы заказлар, шул ук шартларда (LLPS буферы), ләкин поликация булмаганда, Флуоресцент Корреляция Спектроскопиясе (FCS, өстәмә рәсемне кара). (D = 8 ± 4 µm2 / s).Шуңа күрә, αS тәрҗемәсе кинетикасы молекуляр күпләп эффект аркасында таралган этаптагы протеиннар белән чагыштырганда, коакерватларда сизелерлек кими, гәрчә барлык коакерватлар тау фазасыннан аермалы буларак, барлыкка килгәннән соң беренче ярты сәгать эчендә сыеклыкка охшаш үзлекләрен саклыйлар.pLK конденсатында тизрәк кинетика.
электростатик коакерватларда αS динамикасына (2% AF488 маркалы αS) FRAP анализы.Өчпочмактагы αS / Tau441 FRAP анализларының рәсемле рәсемнәре (а) күрсәтелә, анда кызыл түгәрәкләр декоризацияләнгән өлкәләрне күрсәтәләр.Масштаб сызыгы 5 мм.b Уртача FRAP кәкреләре һәм (в) исәпләнгән диффузия коэффициентлары (D) өч эксперименттан 100 µM αS һәм Tau441 (кызыл) яки ΔNt-Tau (зәңгәр) яки pLK (яшел) концентрацияләре ярдәмендә өч эксперименттан. ун тапкыр LLPS концентрациясе.FRAP кәкресенең стандарт тайпылышы күләгәле төстә күрсәтелә.Чагыштыру өчен, таралган этаптагы αS диффузия коэффициенты өчпочмакта флуоресцент корреляция спектроскопиясе (FCS) ярдәмендә билгеләнде (өстәмә рәсемне карагыз һәм күбрәк мәгълүмат алу ысулларын карагыз).d LLPS буферында 100 μM TEMPOL-122-αS өзлексез X-band EPR спектры бернинди поликациясез (кара) яки 100 μM Tau441 (кызыл) яки ΔNt-Tau (зәңгәр) яки 1 мм pLK (яшел).Инсетта иң кырыс үзгәрешләр булган көчле кыр сызыкларының зурланган күренеше күрсәтелә.e 50 μM TEMPOL-122-αS бәйләү кәкреләре LLPS булмаганда төрле поликировкалар белән (PEG юк).Нормальләштерелгән EPR спектрының II (IIII / III) белән чагыштырганда III төркемнең амплитудасы кимегән Tau441 (кызыл), tNt-Tau (зәңгәр) һәм pLK (яшел) моляр катнашлыгын арттыру өчен күрсәтелә.Төсле сызыклар, бер-берсенә охшаган һәм мөстәкыйль бәйләү сайтлары булган тупас бәйләү моделе ярдәмендә мәгълүматларга туры килүен күрсәтәләр.Чимал мәгълүматлары чимал файллары формасында бирелә.
Комплект буларак, без спин маркировкасы (SDSL) һәм өзлексез электрон парамагнит резонансы (CW-EPR) ярдәмендә төрле коакерватларда αS динамикасын тикшердек.Бу ысул реалистик калдык резолюциясе белән IDPның сыгылучылыгын һәм динамикасын хәбәр итүдә бик файдалы булуын исбатлады36,37,38.Бу максаттан без цистин калдыкларын бер Cys мутациясендә төзедек һәм 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-Н-оксил (TEMPOL) әйләнү зонасын кулландык.Малеймид туемнары аларны ярлыклый.Төгәлрәк әйткәндә, без TEMPOL зоналарын 122 яки 24 αS (TEMPOL-122-αS һәм TEMPOL-24-αS) позициясенә куйдык.Беренче очракта, без протеинның C-терминал өлкәсен максат итәбез, ул поликация белән үзара бәйләнештә катнаша.Киресенчә, 24 нче позиция безгә конденсаттагы аксымнарның гомуми динамикасы турында мәгълүмат бирә ала.Ике очракта да таралган фаза белгечләре өчен алынган EPR сигналлары тиз хәрәкәттә торучы нитроксид радикалларына туры килә.Tau яки pLK булганда фаза аерылганнан соң (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 яки ΔNt-Tau 1: 1 нисбәтендә яки pLK 1:10 нисбәтендә), чагыштырмача югары интенсивлыкның артуы күзәтелә. EPR спектры αS.Lossгалту сызыгы киңәйде, тамчыларда αS реориентация кинетикасының эретелгән этаптагы протеин белән чагыштырганда кимүен күрсәтә (3 нче рәсем, өстәмә рәсем 4а).Бу үзгәрешләр 122-нче позициядә ачык күренә. 24-нче позициядә pLK булуы тикшерү кинетикасына тәэсир итмәде, 122-нче урында спектраль сызык формасы сизелерлек үзгәрде (өстәмә рәсем 4а).Ике αS / поликация системасының 122 позициясендә спектрны модельләштерергә тырышканда, гадәттә IDP38,39 спин маркалы динамикасын сурәтләү өчен кулланыла торган изотроп модель (өстәмә рәсем 5а) кулланып, без эксперименталь спектрны реконструкцияли алмадык..24 әйләнеш контрастының позициясен спектраль симуляцияләү (өстәмә рәсем 5а).Бу C-терминал өлкәсенең спин конфигурацияләре киңлегендә поликцияләр булганда өстенлекле позицияләр барлыгын күрсәтә.Эксперименталь EPR шартларында конденсацияләнгән этапта αS өлешен исәпкә алганда (84 ± 2%, 79 ± 7%, һәм αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau, һәм αS / pLK өчен 47 ± 4% - өстәмә карагыз) Мәгълүмат анализының 2е рәсеме в), моны күреп була, EPR ысулы белән ачыкланган киңәйтү, нигездә, C-терминал өлкәсенең конденсацияләнгән этапта төрле поликацияләр белән үзара тәэсирен чагылдыра (TEMPOL-122- кулланганда төп үзгәреш) proteinS), һәм протеин конденсациясе түгел.Зондта микровискозитның артуы күзәтелә.Көтелгәнчә, LLPS-тан башка шартларда протеинның EPR спектры катнашмага 1 M NaCl кушылгач тулысынча торгызылды (өстәмә рәсем 4б).Гомумән алганда, безнең мәгълүматлар CW-EPR тарафыннан ачыкланган үзгәрешләр, нигездә, C-терминал өлкәсенең конденсацияләнгән этапта төрле поликацияләр белән үзара тәэсирен чагылдыра, һәм бу үзара бәйләнеш pLK белән Тау белән чагыштырганда көчлерәк булып күренә.
Кокерваттагы протеиннар турында күбрәк структур мәгълүмат алу өчен, без LLPS системасын NMR кулланып өйрәнергә булдык.Ләкин, без таралган этапта калган αS фракциясен генә таба алабыз, бу коакерват эчендәге протеин динамикасының кимүе һәм NMR анализында чишелеш төбендәге тыгыз фаза аркасында булырга мөмкин.NMR ярдәмендә LLPS үрнәгенең таралган этабында калган протеинның структурасын һәм динамикасын анализлаганда, без протеинның pLK һәм ΔNt-Tau булганда бертөрле эшләвен күрдек. икенчел химик смена һәм R1ρ ял итү буенча экспериментлар ярдәмендә ачылган аксым сөяге икенчел структурасында һәм динамикасында.NMR мәгълүматлары шуны күрсәтә: αS C-терминалы поликацияләр белән үзара бәйләнеше аркасында, протеин эзлеклелеге кебек, тәртипсез табигатен саклап калганда, конформатив сыгылманы югалта.
TEMPOL-122-αS конденсацияләнгән фазада күзәтелгән CW-EPR сигналының киңәюе протеинның поликацияләр белән үзара тәэсирен чагылдырганга, без LLPS булмаганда αSның төрле поликацияләргә бәйләнешен бәяләү өчен EPR титрациясе ясадык. Буфер LLPS), үзара бәйләнешнең эре һәм концентрацияләнгән этапларда бер үк булуын күрсәтеп (бу безнең мәгълүматлар белән раслана, өстәмә рәсем 4а һәм өстәмә рәсем 6).Максат - барлык коакерватларның, гомуми сыеклыкка охшаган үзлекләренә карамастан, молекуляр дәрәҗәдә төп дифференциаль тәртип күрсәтүләрен карау.Көтелгәнчә, EPR спектры поликация концентрациясенең артуы белән киңәйде, барлык үзара бәйләнеш партнерларының молекуляр тәэсире аркасында туенуга кадәр молекуляр сыгылманың кимүен күрсәтә (3-нче рәсем, өстәмә рәсем 6).pLK бу туенуга ΔNt-Tau һәм Tau441 белән чагыштырганда түбән моляр катнашында иреште (поликация: αS).Чынлыкта, n охшаш һәм мөстәкыйль бәйләүче сайтларны күздә тотып, якынча бәйләү моделе белән чагыштыру күрсәтте, pLK (~ 5 μM) аерылган тотрыклылыгы Tau441 яки ΔNt-Tau (~ 50 μM) белән чагыштырганда түбән зурлык тәртибе. ).µM).Бу тупас смета булса да, бу αSның өзлексез уңай корылма өлкәләре белән гади поликировкалар өчен якынрак булуын күрсәтә.SS һәм төрле поликацияләр арасындагы якынлыктагы бу аерманы исәпкә алып, без аларның сыеклык характеристикалары вакыт узу белән төрлечә үзгәрергә мөмкин һәм шулай итеп төрле LSPT процессларыннан интегәбез дип фаразладык.
Протеин коакерваты эчендә бик күп булган мохитне һәм протеинның амилоид табигатен истә тотып, без LSPT процессларын ачыклау өчен вакыт узу белән коакерватның тәртибен күзәттек.BF һәм CF микроскопиясен кулланып (4 нче рәсем), без αS / Tau441 күпчелек күләмдә эремәдә коакерватлашканын күрдек, кое төбендә / слайдта өслекне тоташтырган һәм дымланган зур тамчылар барлыкка китереп, көтелгәнчә (Өстәмә рәсем . 7д);без бу төп структураларны “протеин рафтлары” дип атыйбыз.Бу структуралар сыек булып калдылар, чөнки алар кушылу сәләтен саклап калдылар (өстәмә рәсем 7б) һәм LLPS эшләнгәннән соң берничә сәгать күренергә мөмкин (4 нче рәсем һәм өстәмә рәсем 7c).Без сугару процессының гидрофобик материалларга түгел, ә гидрофилик өслеккә өстенлек биргәнен күзәттек, тигез булмаган зарядлы электростатик коакерватлар көткәнчә һәм шулай итеп югары электростатик өслек потенциалы.Искәртеп узабыз, αS / tNt-Tau коалесенциясе һәм рафтинг сизелерлек кимеде, αS / pLK конденсатлары сизелерлек кимеде (4 нче рәсем).Кыска инкубация вакытында αS / pLK тамчылары гидрофил өслеген берләштерә һәм дымлый алды, ләкин бу процесс тиз туктады һәм 5 сәгать инкубациядән соң, чикләнгән коалесцент вакыйгалар гына булды, дымлану күзәтелмәде.- гель-тамчы күчү.
Вәкил BF (яшел төсле панельләр) һәм CF (уң панельләр, AF488 маркалы αS яшел) коакерват үрнәкләренең LLPS буферында 100 µM Tau441 (өске) флюоресенция) микроскопик рәсемнәр булганда 100 µM αS (1% флуоресцент ярлык) булган коакерват үрнәкләре. -Тау (үзәк) яки 1 мм pLK (аскы) төрле инкубация вакытларында һәм фокаль биеклектә (z, тәлинкә төбеннән ераклык).Тикшеренүләр бер үк нәтиҗәләр белән бер-берсеннән бәйсез рәвештә 4-6 тапкыр кабатланды.αS / Tau441 коакерватлары 24 сәгатьтән соң дымланалар, рәсемнән зуррак рафтлар ясыйлар.Барлык рәсемнәр өчен масштаб 20 мм.
Аннары αS / Tau441 LLPS формалашкан зур сыеклыкка охшаган аксым бассейннары өйрәнелгән протеиннарның амилоид агрегатына китерерме дип сорадык.Вакыт узу белән без WF микроскопиясе белән αS / Tau441 тамчыларының җитлеккәнлеген күзәттек, ләкин 1 μM AF488 маркалы αS һәм Atto647N маркалы Tau441 (5а рәсем).Көтелгәнчә, без җитлеккән процесс дәвамында тулы протеин локализациясен күзәттек.Кызык, ca.5 сәг.Бу таплар alwaysS / tNt-Tau өчен αS / ΔNt-Tau өчен һәрвакыт рафтларда күзәтелә.PLK һәм Tau системаларының тамчыларында аерым таплар юк иде, кушылу / сугару өчен сәләтсез.SS һәм Tau441 булган бу тапларның амилоид сыман агрегатлар булу-булмавын тикшерү өчен, без CF микроскопиясе ярдәмендә шундый ук эксперимент үткәрдек, анда Tau441 Atto647N һәм 12,5 μM амилоид специфик тиофлавин-Т (ThT) кушылган.буяу.ThS / Tau441 тамчылары яки рафталарның ThT-буяу 24 сәгать инкубациядән соң да күзәтелмәсә дә (5б рәсем, өске рәт - протеин рафталары өстендә калган тамчылар), рафт эчендә Atto647N-Tau441 булган ThT-позитив структуралар бик зәгыйфь иде.бу алдан тасвирланган тапларның зурлыгын, формасын һәм урнашкан урынын кабатлый (5б рәсем, урта һәм аскы рәтләр), бу таплар картайган сыеклык коакерватларында барлыкка килгән амилоид сыман агрегатларга туры килергә мөмкинлеген күрсәтә.
WF 25 μM αS төрле инкубация вакытларында һәм фокаль биеклектә (z, чикләнмәгән төбдән ераклык) 25 μM Tau441 (1 μM AF488 маркалы αS һәм Atto647N маркалы Tau441) LLPS буферы булган микроскоп тәлинкә коесында) .Алты эксперимент мөстәкыйль рәвештә охшаш нәтиҗәләр белән кабатланды.b 25 μM αS CF микроскопик образы 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N тамгаланган Tau441) һәм 12,5 μM тиофлавин-Т (ThT) булганда.Протеинның үлчәү тамчылары һәм сакланган протеин рафтлары һәм таплары тиешенчә өске һәм урта рәтләрдә күрсәтелә.Түбән рәттә 3 бәйсез репликадан рафт һәм тамчылар рәсемнәре күрсәтелә.Ак уклар ике панельдә дә ThT-уңай нокталарны күрсәтәләр.Барлык рәсемнәр өчен масштаб 20 мм.
Сыеклыктан катыга күчү вакытында коаксерват белок челтәрендәге үзгәрешләрне җентекләп тикшерү өчен, без флуоресцент гомерлек күзәтү (FLIM) һәм Фөрстер резонансы энергия тапшыру микроскопиясе (ФРЕТ) кулландык (6 нчы рәсем һәм өстәмә рәсемнәр 8 һәм 9).Без фаразладык, катламның коакерват өлгерүе тагын да конденсацияләнгән яки хәтта каты охшаган агрегат структурасына протеин һәм аңа кушылган флуоресцент зонд арасында тыгыз бәйләнешкә китерә, кыскартылган тикшерү гомерендә (τ) потенциаль сүндерү эффектын тудыра. алда әйтелгәнчә40., 41, 42.Моннан тыш, икеләтә маркировкаланган үрнәкләр өчен (AF488 һәм Atto647N, FRET доноры һәм аксессуар буяулары), τ бу кимү шулай ук ​​коакерват конденсациясе һәм LSPT вакытында FRET (E) эффективлыгын арттыру белән бергә булырга мөмкин.Вакыт узу белән без LLPS αS / Tau441 һәм αS / ΔNt-Tau үрнәкләрендә (25 µM LLPS буферындагы 1 µM AF488 булган αS һәм / яки Atto647N Tau441 яки ΔNt-Tau) күзәтелгән.Без гомуми тенденцияне күзәттек, AF488 (τ488) һәм Atto647N (τ647N) зоналарының флуоресцент гомере какерватлар җиткәч бераз кимеде (6-нчы рәсем һәм өстәмә рәсем 8c).Кызык, бу үзгәреш рафталардагы нокталар өчен сизелерлек көчәйтелде (6с рәсем), алга таба протеин конденсациясе нокталарда булганын күрсәтә.Моны яклап, 24 яшькә кадәр αS / tNt-Tau тамчылары өчен флюоресенция гомерендә зур үзгәрешләр күзәтелмәде (өстәмә рәсем 8d), тамчы геляция таплаудан аерылып торган процесс, һәм молекуляр үзгәртеп кору белән бергә булмый. коакерватлар эчендә.Әйтергә кирәк, нокталар αSда төрле зурлыкларга һәм үзгәрүчән эчтәлеккә ия, аеруча αS / Tau441 системасы өчен (өстәмә рәсем 8e).Нечкә флуоресцент гомернең кимүе интенсивлыкның артуы белән үрелеп барды, бигрәк тә Tau441 маркалы Atto647N (өстәмә рәсем 8а), һәм αS / Tau441 һәм αS / ΔNt-Tau системалары өчен югары FRET эффективлыгы, бу LLPS биш сәгать конденсациясен күрсәтә. эшләтеп җибәргәннән соң, статик электр эчендәге аксымнар конденсацияләнде.SS / ΔNt-Tau белән чагыштырганда, без lowerS / Tau441 нокталарында түбән τ647N һәм бераз югарырак τ488 кыйммәтләрен күзәттек, түбән һәм күбрәк бертөрле булмаган FRET кыйммәтләре белән бергә.Мөгаен, бу бәйле булырга мөмкин, αS / Tau441 системасында, агрегатларда күзәтелгән һәм көтелгән αS муллыгы Тау белән чагыштырганда гетероген, еш субстохиометрик, чөнки Tau441 үзе дә LLPS һәм агрегат кичерергә мөмкин (өстәмә рәсем 8e) .Шулай да, Tau441 һәм αS булганда, тамчы коалесенция дәрәҗәсе, раф формалашуы, һәм, иң мөһиме, сыек сыман коакерватлар эчендә аксымнар агрегаты максималь.
LPS / Tau441 һәм αS / tNt-Tau гомерлек флуоресцент микроскопия (FLIM) рәсемнәре 25 μM һәр протеинда (1 μM AF488 маркалы αS һәм 1 μM Atto647N маркалы Tau441 яки ΔNt-Tau) LLPS буферында.Колонналарда төрле җитлеккән вакытта (30 мин, 5 с һәм 24 с) LLPS үрнәкләренең вәкиллекле рәсемнәре күрсәтелә.Кызыл рамка αS / Tau441 таплары булган төбәкне күрсәтә.Гомер озынлыгы төсле барлар рәвешендә күрсәтелә.Барлык рәсемнәр өчен масштаб = 20 µm.b А панельдәге кызыл тартмада күрсәтелгән сайланган мәйданның зурайтылган FLIM рәсеме.Тормыш диапазоны панельдәге кебек төс масштабы ярдәмендә күрсәтелә.Масштаб сызыгы = 5 мм.в Гистограммалар AF488 (αS белән бәйләнгән) яки Atto647N (Тау белән бәйләнгән) төрле протеин төрләре өчен (тамчылар-D-, рафт-R- һәм тап-P) FLIM рәсемнәрендә күрсәтелгән αS- өчен вакыт бүлеп бирү вакыты Tau441 һәм αS / tNt-Tau коакерват үрнәкләре (D өчен N = 17-32 ROI, R өчен 29-44 ROI, һәм баллар өчен 21-51 ROI).Урта һәм уртача кыйммәтләр сары квадратлар һәм тартмалар эчендә кара сызыклар булып күрсәтелә.Сандыкның аскы һәм өске чикләре беренче һәм өченче квартилларны күрсәтәләр, һәм минималь һәм максималь кыйммәтләр 1,5 тапкыр аралар арасындагы диапазонда (IQR) камчы итеп күрсәтелә.Чыгыш ясаучылар кара бриллиант итеп күрсәтелә.Пар бүлүләр арасындагы статистик әһәмият тигез булмаган вариантларны исәпкә алып, ике үрнәк т-тест ярдәмендә билгеләнде.Ике койрыклы т-тест p-кыйммәтләре чагыштырма мәгълүматларның һәр парына йолдызлар белән күрсәтелә (* p-value> 0.01, ** p-value> 0,001, *** p-value> 0.0001, **** p-value> 0.00001), ns Ваемсызлыкны күрсәтә (p-value> 0.05).Төгәл p кыйммәтләре өстәмә таблицада бирелгән, һәм оригиналь мәгълүматлар чимал файллары итеп күрсәтелгән.
Алга таба амилоидка охшаган табигать / агрегатларны күрсәтү өчен, без (1 M) NaCl концентрацияләре белән 24 сәгать дәвамында пычратылмаган коакерват үрнәкләрен эшкәрттек, нәтиҗәдә агрегатларны аксым коакерватларыннан аердылар.Атом көче микроскопиясе (AFM) ярдәмендә изоляцияләнгән агрегатлар (ягъни агрегатларның таралган эремәсе) күзәтелгәндә, без 15 см га якын биеклектәге сферик морфологияне күзәттек, ул югары тоз концентрациясе шартларында берләшергә омтыла. surfaceир өстендәге көчле гидрофобик эффект аркасында типик амилоид фибрилларның тәртибе (фибрилларның гадәттә ~ 10 нм биеклегенә игътибар итегез) (өстәмә рәсем 10а).Кызык, изоляцияләнгән агрегатлар ThT стандарт ThT флуоресцент анализында инкубацияләнгәндә, без ThT флуоресцент квант җитештерүчәнлегенең кискен артуын күзәттек, буяу типик αS амилоид фибриллары белән инкубацияләнгәндә чагыштырганда (10б өстәмә рәсем). коакерват агрегатларында амилоид структуралары бар..Чынлыкта, агрегатлар тозның югары концентрациясенә чыдам булганнар, ләкин типик амилоид фибриллар кебек 4 М гуанидин хлоридына (GdnHCl) сизгер булганнар (өстәмә рәсем 10с).
Алга таба, без бер молекула флюоресенциясен кулланып, агрегатларның составын анализладык, махсус флуоресцент корреляция / кросс-корреляция спектроскопиясе (FCS / FCCS), һәм ике төсле очраклы очракны ачыклау (TCCD).Бу максаттан, без αS һәм Tau441 (икесе дә 25 μM) булган 100 μl LLPS үрнәкләрендә 24 сәгать инкубациядән соң барлыкка килгән агрегатларны аердык, 1 μM AF488 маркалы αS һәм 1 μM Atto647N маркалы Tau441.Нәтиҗәдә таралган агрегат чишелешен мономолекуляр халәткә эретегез, шул ук PEGсыз буфер һәм 1 M NaCl (шул ук буфер агрегатларны коакерваттан аеру өчен кулланыла) LLPS һәм протеин арасында булган электростатик үзара бәйләнешне булдырмас өчен.Бер молекуланың вакыт траекториясенең мисалын 7а рәсемдә күрергә мөмкин.FCCS / FCS анализы (үзара корреляция, CC һәм автокрелеляция, AC) күрсәткәнчә, үрнәкләрдә αS һәм tau булган агрегатлар күп булган (7б рәсемдә CC кәкресен карагыз, сул панель), һәм мономерик протеинның артык булуы а булып барлыкка килгән. эретү процессы нәтиҗәләре (рәсем 7б, сул панельдә AC кәкреләрен карагыз).Мономерик протеиннар булган үрнәкләрне кулланып, бер үк чишелеш шартларында үткәрелгән контроль экспериментлар CC кәкреләрен күрсәтмәделәр, һәм AC кәкреләре бер компонентлы диффузия моделе белән яхшы туры килә, монда мономерик протеиннар көтелгән диффузия коэффициентлары бар (7б рәсем). ), уң панель).Агрегатланган кисәкчәләрнең диффузия коэффициенты 1 µm2 / s-тан, ә мономерик протеиннарның күләме 1 µm2 / s тирәсе.50–100 µm / s;кыйммәтләр моңа кадәр бастырылган кыйммәтләргә охшаш αS амилоид фибриллары һәм мономерик αS охшаш чишелеш шартларында аерым44.TCCD шартлау анализы белән агрегатларны анализлаганда (7-нче рәсем, өске панель), без һәрбер изоляцияләнгән агрегатта (αS / Tau heteroaggregate) ачыкланган агрегатларның якынча 60% αS һәм tau булганын, 30% тирәсе генә булганын ачыкладык. тау, якынча 10% αS гына.SS / Tau гетероагрегатларына стохиометрик анализ күрсәткәнчә, гетероагрегатларның күбесе тауда баетылган (стохиометрия 0,5 дән түбән, агрегатка тау молекулаларының уртача саны αS молекулаларына караганда 4 тапкырга күбрәк), бу безнең ситудагы FLIMда күзәтелгән эшебезгә туры килә; экспериментлар..ФРЕТ анализы күрсәткәнчә, бу агрегатларда ике протеин да бар, ләкин бу очракта фактик FRET кыйммәтләре зур әһәмияткә ия түгел, чөнки экспериментта кулланылган язылмаган протеинның артык булуы аркасында һәр агрегатта флорофорларның таралуы очраклы булган.Кызык, без 45,46 җитлеккән амилоид агрегат-дефицит Тау вариантын кулланып бер үк анализ ясаганда (өстәмә рәсем 11а, б) карагыз, αS электростатик агрегат бер үк булса да (өстәмә рәсем 11c, d), коакерват эчендә агрегатлар формалаштыру сәләте кискен кимеде һәм FLIM ситу экспериментларында берничә тап тапты, һәм изоляцияләнгән агрегат үрнәкләре өчен зәгыйфь корреляция кәкреләре күзәтелде.Ләкин, аз санлы ачыкланган агрегатлар өчен (Tau441нең уннан бере генә), без һәр агрегатның бу Tau вариантына караганда αS белән баетылганын күрдек, ачыкланган агрегатларның якынча 50% αS молекулалары булган, һәм αS артык гетероген булган. .агрегатлар (өстәмә рәсемне карагыз 11e), Tau441 барлыкка китергән гетероген агрегатлардан аермалы буларак (6ф рәсем).Бу экспериментлар нәтиҗәләре күрсәткәнчә, αS үзе коакерват эчендә тау белән туплана алса да, тау нуклеяциясе бу шартларда уңайлырак, һәм амилоид сыман агрегатлар αS һәм тау формасы булып эшли ала.Ләкин, тауга бай үзәк формалашкач, αS һәм tau арасында гетеротипик үзара бәйләнешләр агрегатларда тау молекулалары арасындагы гомотипик үзара бәйләнешләргә өстенлек бирәләр;без шулай ук ​​сыек αS / tau coacervates протеин челтәрләрен күзәтәбез.
αS / Tau441 электростатик коакерватларда формалашкан изоляцияләнгән агрегатларның бер молекулаларының вакытлыча эзләре.SS / Tau441 коагрегатларына туры килгән шартлаулар (күрсәтелгән бусагадан өстен шартлау) өч ачыклау каналында күзәтелде (туры дулкынланудан соң AF488 һәм Atto647N эмиссиясе, зәңгәр һәм кызыл сызыклар, турыдан-туры дулкынланудан соң Atto647N эмиссиясе), ФРЕТ, кызгылт сызык).b LLPS (сул панель) алынган изоляцияләнгән αS / Tau441 агрегатлары үрнәгенә FCS / FCCS анализы.AF488 һәм Atto647N өчен автокрелеляция (AC) кәкреләре зәңгәр һәм кызыл төстә күрсәтелә, һәм ике буяуны да үз эченә алган агрегатлар белән бәйләнгән кросс-корреляция (CC) кәкреләре кызгылт төстә күрсәтелә.AC кәкреләре мономерик һәм агрегатланган протеин төрләренең булуын күрсәтәләр, ә CC кәкреләре икеләтә маркалы агрегатларның диффузиясен күрсәтәләр.Шул ук анализ, ләкин аерымланган нокталардагы кебек үк, мономерик αS һәм Tau441 булган үрнәкләр уң панельдә контроль булып күрсәтелә.в αS / Tau441 электростатик коакерватларда формалашкан изоляцияләнгән агрегатларның бер молекулаларына флуоресцент флеш анализы.Дүрт төрле кабатлауда табылган һәр агрегат өчен мәгълүмат (N = 152) аларның стохиометриясенә, S кыйммәтләренә, һәм FRET эффективлыгына каршы планлаштырылган (өске панель, төс сызыгы күренешне чагылдыра).Өч төр агрегатны аерырга мөмкин: -αS-S ​​~ 1 һәм FRET ~ 0 белән агрегатлар, S ~ 0 һәм FRET ~ 1 белән Тау-агрегатлар, һәм S һәм FRET арадашлы Tau / αS агрегатлары сумма сметалары. гетероген агрегатта (N = 100) ачыкланган ике маркер протеины аскы панельдә күрсәтелгән (төс масштабы вакыйганы чагылдыра).Чимал мәгълүматлары чимал файллары формасында бирелә.
Сыек белок конденсатларының өлгерүе яки картайуы гел шикелле яки каты структураларга әйләнде, хәбәр ителгәнчә, конденсатның берничә физиологик функциясендә, шулай ук ​​авыруларда, амилоид агрегаты алдыннан аномаль процесс буларак, 7, 48, 49. Монда без фазаны аеруны һәм тәртипне җентекләп өйрәнәбез.Түбән микромоляр концентрацияләрдә һәм физиологик яктан тиешле шартларда контроль мохиттә очраклы поликацияләр булганда LSPT αS (искәртегез: αSның исәпләнгән физиологик концентрациясе> 1 µM50), LPS типик термодинамик йөртелгән тәртип буенча.Без физиологик рНда бик тискәре корылган C-терминал өлкәсен үз эченә алган αS, электростатик процесс аша pLK яки Tau кебек югары катион бозылган пептидлар булганда, LLPS аша су эремәсендә протеинга бай тамчылар ясый алуын ачыкладык. агрегат макромолекулалары булганда катлаулы конденсация.Бу процесс кәрәзле мохиттә тиешле эффектларга ия булырга мөмкин, анда αS витрода да, vivo51,52,53,54 дә аның авыру белән бәйле агрегаты белән бәйле төрле поликацион молекулалар белән очраша.
Күпчелек тикшеренүләрдә тамчылар эчендәге протеин динамикасы җитү процессын билгеләүче төп факторларның берсе булып саналды55,56.Электростатик αS поликация белән коакерватларда, җитлеккәнлек процессы, күрәсең, поликацияләр белән үзара бәйләнешнең көченә, валентлыгына һәм бу үзара бәйләнешнең күплегенә бәйле.Тигезлек теориясе ике сыек хәлнең тигезлек пейзажы LLPS57,58 йөртүче биополимерларга бай зур тамчы булу булачагын күрсәтә.Тамчы үсешенә Оствальд җитлеккәнлеге 59, коалесценс60 яки таралган этапта ирекле мономер куллану ярдәмендә ирешеп була.SS һәм Tau441, tNt-Tau яки pLK өчен, протеинның күпчелеге бу тикшеренүдә кулланылган шартларда конденсатта тупланган.Ләкин, тулы размерлы тау тамчылары өслекне сөртүдә тиз кушылса да, tNt-Tau һәм pLK өчен тамчы коалесенциясе һәм сугару авыр булды, бу ике системада сыеклыкның тиз югалуын күрсәтә.Безнең FLIM-FRET анализы буенча, олы яшьтәге pLK һәм tNt-Tau тамчылары оригиналь тамчылар кебек үк аксым агрегатының дәрәҗәсен күрсәттеләр (оригиналь флюоресенция гомере), төп белок челтәре сакланган булса да, катырак булса да.
Без эксперимент нәтиҗәләрен түбәндәге модельдә рационализациялибез (8 нче рәсем).Башта вакытлыча формалашкан тамчылар еш кына электростатик компенсациясез протеин челтәрләре, һәм шулай итеп корылма тигезсезлеге өлкәләре бар, аеруча тамчы интерфейсында, нәтиҗәдә югары электростатик өслек потенциалы булган тамчылар.Корылманы компенсацияләү өчен (гадәттә валентларның бетүе дип аталган күренеш) һәм тамчыларның өслек потенциалын киметү өчен, тамчылар эретелгән этаптан яңа полипептидлар кертә ала, корылма корылмаларын оптимальләштерү өчен протеин челтәрләрен үзгәртә һәм башка тамчылар белән үзара бәйләнештә була ала.өслекләр белән (дымлау).ProteinS / pLK тамчылары, аларның гадирәк протеин челтәре аркасында (αS һәм pLK арасында гетеротипик үзара бәйләнешләр) һәм протеин-протеинның үзара бәйләнешенә зуррак якынлык аркасында, конденсат корылмасын тизрәк тигезли алалар кебек;чыннан да, без αS / TaL белән чагыштырганда αS / pLK коакерватларында тизрәк протеин кинетикасын күзәттек.Валентлык беткәннән соң, үзара тәэсир итү азрак эфемер була һәм тамчылар сыеклык үзлекләрен югалта һәм түбән электростатик өслек потенциалы булган гель сыман, янмый торган тамчыларга әйләнәләр (һәм шуның өчен өслекне дымлый алмыйлар).Моннан аермалы буларак, complexS / Tau тамчылары катлаулырак протеин челтәрләре аркасында (гомотипик һәм гетеротипик үзара бәйләнештә) һәм протеинның үзара бәйләнешенең зәгыйфь табигате аркасында тамчы корылма балансын оптимальләштерүдә азрак эффектив.Бу тамчыларга озак вакыт сыек тотышны саклый торган һәм югары электростатик өслек потенциалын күрсәтә, бу берләшү һәм үсү белән минимумга омтыла (шулай итеп тамчыларның өслек мәйданын / күләм күләмен киметә) һәм гидрофилик өслек химын сөртеп.Бу эре концентрацияләнгән протеин китапханәләрен барлыкка китерә, алар сыеклык үзлекләрен саклыйлар, чөнки протеин челтәрендә заряд оптимизациясен даими эзләү аркасында үзара бәйләнеш бик вакытлы булып кала.Шунысы кызык, Тауның N-терминалы киселгән формалары, шул исәптән кайбер табигый булган изоформалар62, арадаш тәртип күрсәтәләр, кайбер коакерватлар αS белән озын гомерле гел тамчыларына, калганнары зур сыек конденсатларга әйләнәләр.ElectrС электростатик коакерватларның җитлеккәнлегендә бу икелелек соңгы LLPS теоретик һәм эксперименталь тикшеренүләргә туры килә, алар конденсатның валентның бетүе һәм электростатик чистарту арасындагы бәйләнешне ачыкладылар, конденсат зурлыгын һәм сыеклык үзлекләрен контрольдә тоту өчен ачкыч.Механизм 58.61.
Бу схема LLPS һәм LSPT аша αS һәм Tau441 өчен потив амилоид агрегат юлын күрсәтә.Өстәмә анионга бай (кызыл) һәм катионга бай (зәңгәр) регионнар белән, αS һәм тау электростатик коакерватлары канәгатьләнерлек валентлы өслек энергиясенә ия, шуңа күрә аз коалесценция, тиз тамчы картайуга китерәләр.Тотрыклы агломерацияләнмәгән гель халәтенә ирешәләр..Бу хәл αS / pLK системасы өчен бик уңайлы, якынрак булуы һәм гади протеинга охшаш үзара бәйләнеш челтәре аркасында, бу гел шикелле тиз күчү мөмкинлеген бирә.Киресенчә, канәгатьләнерлек булмаган валентлы тамчылар һәм, димәк, үзара бәйләнештә булган протеин белән зарарланган төбәкләр, коакерватка гидрофилик өслекне эретү һәм дымландыруны җиңеләйтәләр, аның югары өслек энергиясен киметү өчен.Бу хәл αS / Tau441 коакерватлары өчен яхшырак, аларда зәгыйфь Tau-Tau һәм αS-Tau үзара бәйләнештән торган күпкырлы катлаулы челтәр бар.Turnз чиратында, зуррак коакерватлар сыеклыкка охшаган үзлекләрен җиңелрәк саклап калачаклар, бу протеин белән протеинның үзара бәйләнешен булдырырга мөмкинлек бирәчәк.Ахырда, коакерват сыеклык эчендә αS һәм тау формасын үз эченә алган амилоид гетероген агрегатлар, нейродженератив авырулар билгеләре булган инклюзия органнарында булганнары белән бәйле булырга мөмкин.
Зур сыеклыкка охшаган структуралар αS / Tau441 җиткән вакытта формалашкан, ләкин бик тыгыз, ләкин динамик протеин мохите һәм азрак дәрәҗәдә αS / tNt-Tau коакерватлары протеин агрегатының нуклеяциясе өчен идеаль сусаклагычлар.Без чыннан да αS һәм tau булган протеин коакерватларының бу төрендә каты протеин агрегатларының барлыкка килүен күзәттек.Без күрсәттек, бу гетероагрегатлар электростатик булмаган үзара бәйләнешләр белән тотрыклыланалар, амилоид специфик ThT буяуларын типик амилоид фибриллар белән бәйлиләр, һәм төрле йогынтыга охшаш каршылык күрсәтәләр.LLPS формалаштырган αS / tau агрегатлары амилоидка охшаган.Чыннан да, амилоид агрегатында Тау дефицитының җитлеккән варианты сыек электростатик коакерват эчендә бу гетероген αS агрегатларның формалашуында сизелерлек бозыла.SS / Tau441 агрегатларының формалашуы коакерватлар эчендә генә күзәтелә, алар сыеклыкка охшаган үзлекләрне саклыйлар, һәм беркайчан да, коакерватлар / тамчылар гель хәленә җитмәсәләр.Соңгы очракта, электростатик үзара бәйләнешнең көчәюе һәм, нәтиҗәдә, протеин челтәренең катгыйлыгы амилоид нуклеяциясе өчен кирәк булган яңа белок үзара бәйләнешне булдыру өчен, протеиннарның кирәкле конформацион үзгәрешләрен булдырмый.Ләкин, моны тагын да сыгылучан, сыеклыкка охшаган коакерватларда ирешеп була, алар үз чиратында сыек булып калырга мөмкин.
Конденсацияләнгән этап эчендә агрегатлар формалашу зур αS / Tau конденсатларында тиз килүче кечкенә тамчыларга караганда өстенрәк булуы, тамчы коалесенциясен контрольдә тотучы факторларны ачыклауның актуальлеген күрсәтә.Шулай итеп, фазаны аеру тенденциясе генә түгел, конденсатның зурлыгы дөрес эшләү өчен, шулай ук ​​авыруларны профилактикалау өчен контрольдә тотылырга тиеш 58,61.Безнең нәтиҗәләр шулай ук ​​LLPS һәм LSPT арасында αS / Tau системасы өчен балансның мөһимлеген күрсәтәләр.Тамчы формалашуы амилоид агрегатыннан саклый алса да, башка системаларда тәкъдим ителгәнчә, туендыру шартларында булган протеин мономерларының күләмен киметеп, 63,64, югары тамчы дәрәҗәсендә тамчы кушылуы әкрен конформацион үзгәртеп корулар аркасында эчке белок агрегатына китерергә мөмкин.белок челтәрләре..
Гомумән алганда, безнең мәгълүматлар LSPT контекстында бердәм валентның актуальлеген һәм тамчы челтәрләрдә канәгать / канәгать булмаган үзара бәйләнешне ассызыклый.Аерым алганда, без күрсәтәбез, тулы озынлыктагы αS / Tau441 конденсатлары эффектив кушылырга һәм нуклеатлашырга сәләтле, амилоид сыман гетероагрегатлар барлыкка китерә, алар протеиннарны да үз эченә ала һәм безнең эксперимент нәтиҗәләре нигезендә молекуляр механизм тәкъдим итә.Без монда хәбәр иткән αS / Tau сыеклык коакерватында ике протеинның берләшүе, чыннан да, авыру билгеләре булган инклюзиядә ике протеинның локализациясе белән бәйле булырга мөмкин, һәм LLPS белән бәйләнешне аңларга булыша ала. амилоид агрегаты, нейродженерациядә бик зарядлы IDP өчен юл ача.
Мономерик WT-αS, цистин мутацияләре (Q24C-αS, N122C-αS) һәм ΔCt-αS вариантлары (Δ101-140) Э.Колида күрсәтелде һәм алдан әйтелгәнчә чистартылды.5 мм DTT диффид бәйләнеше барлыкка килмәсен өчен αS цистин мутацияләрен чистартуның барлык адымнарына кертелде.Tau441 изоформасы (Аддгеннан алынган плазмид 16 16316), tNt-Tau варианты (Δ1-150, CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) пример) Э.Коли культуралары булган OD600 = 0.6–0.7 37 ° C һәм 180 әйләнештә үскән, һәм белдерү IPTG белән 3 сәгать 37 ° C тәэсирендә китерелгән.11,500 хг урып-җыю күзәнәкләрен 4 минутта 15 минутта һәм 150 мм NaCl булган тозлы буфер белән юыгыз.Планетаны лизис буферында торгызыгыз (1 L LB өчен 20 мл: MES 20 мм, pH 6.8, NaCl 500 мм, EDTA 1 мм, MgCl2 0,2 ​​мм, DTT 5 мм, PMSF 1 мм, бензамидин 50 μМ, копептин 100 μM).Соникация адымы 10 импульс өчен 80% амплитуда белән боз өстендә башкарылды (1 минут, 1 минут ял).Бер УЗИда 60 млтан артмагыз.Э.Коли лизатлары 95 ° C температурада 20 минут җылытылды, аннары боз өстендә суытылды һәм 40 минут эчендә 127,000 × г центрифугацияләнде.Ачыкланган супернатант 3,5 kDa мембранасына (Spectrum ™ Thermo Fisher Scientific, Бөекбритания) кулланылды һәм 4 л диализ буферына (20 мм MES, pH 6.8, NaCl 50 мм, EDTA 1 мм, MgCl2 2 мм, DTT 2 мм) диализлаштырылды. , PMSF 0,1 мм) 10 сәгать.5 мл катион алмашу баганасы (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, АКШ) тигезләнү буферы белән тигезләнде (20 мм MES, pH 6.8, 50 мм NaCl, 1 мм EDTA, 2 мм MgCl2, 2 мм DTT, 0,1 мм PMSF).Тау лизаты 0,22 мм PVDF фильтры аша чистартылды һәм баганага 1 мл / мин тизлек белән кертелде.Элитация әкренләп башкарылды, тау 15-30% элитация буферы белән ясалды (20 мм MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 мм EDTA, 2 мм MgCl2, 2 мм DTT, 0,1 мм PMSF).Фракцияләр SDS-PAGE тарафыннан анализланган, һәм тауның көтелгән молекуляр авырлыгы булган бер полоса булган теләсә нинди фракцияләр 10 kDa центрифуга фильтры ярдәмендә тупланган һәм 10 мм HEPES, pH 7.4, NaCl 500 мм һәм DTT 2 мм булган буфер белән алыштырылган. соңгы протеин концентрациясе 100 μM булган.Протеин эремәсе 0,22 μm PVDF фильтры аша үтте, тиз туңдырылды һәм -80 ° C сакланды.Протеин K18 профессор Альберто Боффи белән игелекле тәэмин ителде.SDS-PAGE һәм MALDI-TOF / TOF раслаганча әзерлекнең чисталыгы> 95% иде.Төрле цистиннар химик яктан AlexaFluor488-менимид (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, АКШ) яки TEMPOL-maleimide (Торонто тикшеренү химиясе, Торонто, Канада) белән маркировкаланган.сеңдерү һәм MALDI-TOF / TOF белән расланды.Tau441, tNt-Tau, AggDef-Tau һәм K18 шул ук процедура буенча Atto647N-менимид (ATTO-TEC GmbH, Сиген, Германия) ярдәмендә 191 һәм 322 позицияләрдә туган цистин калдыклары белән маркировкаланган.IdS һәм Tau441 калдык карталарына чиста корылма CIDER66 ярдәмендә ясалган.
Каты поли-Л-лизин (pLK DP 90-110, NMR тәэмин итүчесе, Аламанда Полимерс Inc, Хантсвилл, Алабама, АКШ) 10 мм HEPES, 100 мм NaCl, pH 7.4 - 10 мм концентрациядә эретелде, процесс 5 өчен эшләнгән. минутлар УЗИ су мунчасында һәм -20 ° C саклагыз.PEG-8, декстран-70, FITC-PEG-10 (Биохимпег, Уотертаун, MA, АКШ) һәм FITC-декстран-500 (Сигма-Альдрих, Сант-Луис, Ми, АКШ) суда эриләр һәм LLPS буферында киң таралалар.Диализ пычратучы тозларны бетерә.Аннары алар 0,22 мм зурлыктагы шприц фильтры аша чистартылды, һәм аларның концентрацияләре рефрактометр ярдәмендә исәпләнде (Метлер Толедо, Коламбус, Огайо, АКШ).LLPS үрнәкләре бүлмә температурасында түбәндәге тәртиптә әзерләнде: буфер һәм экструзия катнаш һәм 1 мм трис (2-карбоксиетил) фосфин (TCEP, Карбосинт, Комптон, Бөекбритания), 1 мм 2,2,2,2- (Этан- 1, 2-дилдинитрил) тетраацетик кислотасы (EDTA, карбоксинт) һәм 1% протеаз ингибиторы катнашмасы (PMSF 100 мм, бензимид 1 мм, лепептин 5 μM).Аннары αS һәм кушылган поликацияләр (pLK яки Tau вариантлары) өстәлә.Тиофлавин-Т вакыт серияләре экспериментлары өчен (ThT, Carbosynth, Compton, UK), гомуми ThT концентрациясен αS концентрациясенең яртысы итеп кулланыгыз.Аларның бер тигез булуын тикшерү өчен үрнәкләрне йомшак, ләкин яхшылап кушыгыз.Eachәрбер компонентның концентрациясе, нәтиҗәләр бүлегендә күрсәтелгәнчә, эксперименттан экспериментка кадәр үзгәрде.Азид экспериментның дәвамлылыгы 4 сәгатьтән артканда 0,02% (w / v) концентрациясендә кулланылган.LLPS үрнәкләрен кулланып барлык анализлар өчен, катнашуны анализ алдыннан 5 минутка тигезләргә рөхсәт итегез.Lightиңел таралу анализы өчен, 150 µл үрнәк бәйләнмәгән 96 кое микроплиталарга (leClear®, кара, F-Bottom / Балык кое, Гринер био-бер, Кремсмюнстер, Австрия) йөкләнде һәм ябыштыргыч пленка белән капланды.LLPлар CLARIOstar тәлинкә укучысында (BMG Labtech, Ортенберг, Германия) чишелеш үзәгендә 350 нм үзләштерүне үлчәп күзәттеләр.Тикшеренүләр 25 ° C температурада өч тапкыр үткәрелде, һәм хаталар уртача стандарт тайпылыш булып исәпләнде.Эретү фазасы центрифугация үрнәге һәм SDS-PAGE гел анализы белән бәяләнде, һәм эретелгән һәм концентрацияләнгән этапларда αS фракциясе төрле LLPS эремәләрендә күләмләнде.1 μM AF488 маркалы αS булган 100 μl LLPS үрнәге яхшылап катнашып әзерләнде, аннары центрифугация 30 минут эчендә 9600 × г тәшкил итте, аннан соң явым-төшем гадәттә күренде.Супернатантның иң яхшы 50 μл SDS-PAGE гели ярдәмендә протеин күләмендә кулланылды.Гельләр ChemiDoc гел күзәтү системасы (Bio-Rad лабораторияләре, Геркулес, Калифорния, АКШ) ярдәмендә AF488 фильтрлары белән сканерланган яки Coomassie таплары белән буялган һәм тиешле фильтрлар белән визуальләштерелгән.Нәтиҗә ясалган төркемнәр ImageJ версиясе 1.53i (Милли Сәламәтлек Институтлары, АКШ) ярдәмендә анализланды.Тикшеренүләр охшаш нәтиҗәләр белән ике төрле экспериментта икеләтә үткәрелде.
Гадәттә, 150 μл үрнәк бәйләнмәгән 96 кое микроплитасына кулланылды һәм Leica DMI6000B инверсия микроскопта бүлмә температурасында визуальләштерелде (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия).Шулай ук ​​экспериментлар өчен µ-Слайд Ангиогенез тәлинкәләре (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германия) яки 96 кое полистирол микроплаталары (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) кулланылды.EL6000 галоген яки сымап металл галид лампалары яктырту чыганагы буларак кулланылган (BF / DIC һәм WF тасвирламасы өчен).WF микроскопиясе өчен яктылыкны үрнәккә юнәлтү һәм җыю өчен 40х зурайту һава максаты (Leica Microsystems, Германия) кулланылды.AF488 һәм ThT маркалы үрнәкләр өчен, фильтр дулкынландыру һәм стандарт GFP фильтр комплектлары, дулкынландыру һәм чыгару полосасы фильтрлары, тиешенчә, 460-500 нм һәм 512–542 нм полоса фильтрлары, һәм 495 нм дихрой көзге.Atto647N маркалы үрнәкләр өчен, Cy8 фильтрларының дулкынландыргыч һәм эмиссия полосасы фильтрлары 628-40 нм һәм 692-40 нм, һәм 660 нм дихрой көзге кулланылды.BF һәм DIC микроскопиясе өчен бер үк чагылган яктылык җыю максатын кулланыгыз.Lightыелган яктылык Leica DFC7000 CCD камерасында яздырылган (Leica Microsystems, Германия).Экспозиция вакыты BF һәм DIC микроскопия күзаллау өчен 50 мс, WF микроскопия күзәтү өчен 20-100 мс.Чагыштыру өчен, ThT белән барлык экспериментлар өчен экспозиция вакыты 100 мс иде.Тамчы коалесенциясен күз алдына китерү өчен вакыт аралыгында экспериментлар үткәрелде, рәсемнәр 100 минут саен берничә минут эчендә җыелды.ImageJ (NIH, АКШ) рәсем анализы өчен кулланылды.Тикшеренүләр охшаш нәтиҗәләр белән өчпочмакта үткәрелде.
Колокализация экспериментлары, FRAP һәм 3D реконструкция өчен ZEN LSM 880 инвервер конокаль микроскопта ZEN 2 зәңгәр басмасы ярдәмендә алынган (Карл Зейс АГ, Оберкочен, Германия).50 µл үрнәкләре µ-Слайд Ангиогенез Петри ашамлыкларына кулланылды (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Германия), гидрофилик полимер белән эшкәртелде һәм 63 × нефтькә чумдыру максатына куелды (План-Апохромат 63 × / NA 1.4 Нефть) DIC буенча).Рәсемнәр 458 нм, 488 нм, һәм 633 нм аргон лазер сызыклары ярдәмендә алынган, 0,26 мм / пиксель һәм 470-600 нм, 493–628 нм, дулкынлану һәм эмиссияне ачыклау тәрәзәләре өчен 8 µs / пиксель экспозиция вакыты. һәм 638–755 nm ThT, AF488 һәм Atto647Nны күз алдына китерү өчен кулланылды.ФРАП экспериментлары өчен, һәр үрнәкнең вакыт аралыгында фотографиясе секундына 1 кадрда яздырылды.Тикшеренүләр охшаш нәтиҗәләр белән бүлмә температурасында өчпочмакта үткәрелде.Барлык рәсемнәр дә Zen 2 зәңгәр басма программасы ярдәмендә анализланган (Carl Zeiss AG, Оберкочен, Германия).FRAP кәкреләре нормальләштерелде, планлаштырылды һәм OriginPro 9.1 ярдәмендә Zen 2 ярдәмендә рәсемнәрдән алынган интенсивлык / вакыт мәгълүматларына туры китерелде.Бетерү кәкреләре моно-экспоненциаль модельгә урнаштырылды, молекуляр диффузияне исәпкә алу өчен, өстәмә экспоненциаль термин белән, агарту эффектын исәпкә алу өчен.Аннары без D номиналь агарту радиусын һәм Канг һәм башкалар тигезләмәсендәге алдан билгеләнгән торгызу ярты гомерен кулланып исәпләдек.5 35 күрсәтелгән.
SСның бер цистин вариантлары 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксил (TEMPOL) белән 24 (TEMPOL-24-αS) һәм 122 (TEMPOL-122-αS) белән синтезланган, тиешенчә.Спин маркировкасы EPR экспериментлары өчен αS концентрациясе 100 μM, PEG концентрациясе 15% тәшкил итте (w / v).Төрле агрегат шартлары өчен αS: pLK нисбәте 1:10 булган, αS: tNt-Tau һәм αS: Tau441 нисбәтләре 1: 1дә сакланган.Күпчелек кеше булмаганда, титрация экспериментларын бәйләү өчен, TEMPOL-122-αS 50 μM сакланган һәм поликацияләр концентрацияләрне арттыруда титрланган, һәр шартны аерым әзерләгән.CW-EPR үлчәүләре Bruker ELEXSYS E580 X-band спектрометры ярдәмендә үткәрелде, Bruker ER4118 SPT-N1 резонаторы белән җиһазландырылган, микродулкынлы (SHF) ешлыкта .7 9,7 ГГц ешлыгында.Температура 25 ° C дәрәҗәсендә куелган һәм сыек азот криостаты белән идарә ителә.Спектрлар туенмаган шартларда 4 МВт көче, модуляция амплитудасы һәм 100 кГц модуляция ешлыгы белән алынган.Спектраль интенсивлык үрнәкләр арасындагы спин концентрацияләре һәм Tau441 яки ΔNt-Tau булган үрнәкләрдә киметүче агентларның калдык концентрацияләре аркасында спин концентрацияләренең аермасын булдырмас өчен нормальләштерелде.G-ның бирелгән кыйммәтләре Matlab®67-да тормышка ашырылган Easyspin программа тәэминаты (6.0.0-dev.34) ярдәмендә башкарылган EPR спектраль модельләштерү нәтиҗәсендә алынган.Мәгълүматны модельләштерү өчен бер / ике компонентлы изотроп модельләр кулланылды.Барлык сигналларны нормальләштергәннән соң, калдыклар һәр симуляцияне тиешле эксперимент спектрыннан алу белән исәпләнде.Титрлаштыру анализы өчен, полосаларның αS белән бәйләнешен күзәтү өчен, нормальләштерелгән EPR спектрының икенче төркеменә (IIII / III) чагыштырмача интенсивлык кулланылды.Аерылу даими (Kd) бәяләү өчен, барлыкка килгән сызык n охшаш һәм мөстәкыйль бәйләү сайтларын күздә тотып якынча модельгә урнаштырылды.
NMR спектроскопия экспериментлары криопроб һәм Z-градиент белән җиһазландырылган Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR спектрометры ярдәмендә үткәрелде.Барлык экспериментлар да 130–207 µM αS һәм тиешле αS / ΔNt-Tau һәм pLK эквивалентларын 10 мм HEPES, 100 мм NaCl, 10% DO, pH 7.4 кулланып башкарылды һәм 15 ° C температурада башкарылды.NMR тарафыннан LPS мониторингы өчен, катнаш катнаш үрнәкләргә 10% PEG кушылды.Химик смена пертурбация участогы (1б рәсем) уртача 1H һәм 15N химик сменаны күрсәтә.SS 2D1H-15N HSQC спектры алдагы биремгә нигезләнеп билгеләнде (BMRB керү # 25227) һәм HNCA, HNCO һәм CBCAcoNH 3D спектрын яздырып анализлау белән расланды.13Cα һәм 13Cβ химик сменалар tNt-Tau яки pLK булганда исәпләнде, саф очраклы индуктивлык кәтүгенең αS химик сменалары белән чагыштырганда икенчел структура тенденцияләрендә булган үзгәрешләрне үлчәү өчен (өстәмә рәсем 5c).R1ρ ставкалары hsqctretf3gpsi экспериментларын язу белән үлчәнде (Брукер китапханәсеннән алынган) 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, һәм 800 мс тоткарлыклар белән, һәм экспоненциаль функцияләр төрле интенсивлык тоткарлауларына көйләнде. R1ρ һәм аның эксперименталь билгесезлеген билгеләү вакытлары.
Ике төсле вакыт белән чишелгән флуоресцент микроскопия экспериментлары коммерция вакыты белән чишелгән MT200 флюоресенция конокаль микроскопында (PicoQuant, Берлин, Германия) вакыт корреляцияләнгән бер фотон санау (TCSPC) җайланмасы белән үткәрелде.Лазер диод башы импульслы интерлеавтлы дулкынлану өчен кулланыла, нур бер режимда дулкынландыргыч аша уза һәм 481 нм өчен 10 - 100 нВт лазер көченә һәм дихрой көзгедән соң үлчәнгән 637 нм лазер сызыкларына көйләнгән.Бу фотонны оптималь санауны тәэмин итә, фотонны читләтеп җибәрү, фотоблечинг һәм туендыру эффектларыннан саклый.μ-Слайд ангиогенез каплагычлары яки тәлинкәләре (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германия) корректив ягы булган Супер Апохромат 60x NA 1,2 линзасы өстендә чумдырылу суына урнаштырылды (Олимп Тормыш Фәннәре, Уолтам, АКШ).488/640 нм дихрой көзге (Семрок, Урман күле, IL, АКШ) төп нур бүлүче буларак кулланылды.Эшләнмәгән нурланыш диаметры 50 микрон булган тишек белән блоклана, аннары фокусланган нурланыш 2 ачыклау юлына 50/50 нур бүлүчегә бүленә.Детектор алдында тасма чыгару фильтрлары (Семрок, Урман күле, IL, АКШ) 520/35 яшел буяу өчен (AF488) һәм 690/70 кызыл буяу өчен (Atto647N) детектор алдында кулланылды.Детектор буларак бер фотонлы кар көчләре диодлары (SPAD) (Микро Фотон җайланмалары, Болзано, Италия) кулланылды.Мәгълүмат җыю һәм анализ коммерциядә булган SymphoTime64 программасын кулланып башкарылды (PicoQuant GmbH, Берлин, Германия).
LLPS үрнәкләренең илле микролитеры μ-Слайд ангиогенез скважиналарына кулланылды (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германия).Нәтиҗә ясалган рәсемнәр, асылынган тамчылар өчен оптималь объектив эш аралыгы өчен, кое төбеннән 20 мм, ә ким дигәндә 0,25 µm / пиксельнең аксаль резолюциясе һәм 400 µs / пиксель тоткарлану вакыты белән 1 µm.Channelәрбер канал өчен уртача фон сигнал интенсивлыгына (ПБГ, уртача + 2σ) интенсивлык бусагасын кулланып мәгълүматны сайлагыз, шуңа күрә сыек протеин тамчылары, рафталар яки таплар гына сайлап алына, таралып беткән этаптан килеп чыга.Channelәрбер каналның (τ) гомер озынлыгын анализлау өчен (яшел, AF488 өчен “г” һәм кызыл, Atto647N өчен “r”), тамчылар, рафтлар яки таплар булган кызыклы төбәкләрне сайладык (өстәмә рәсем 1 ).8б) һәм аларны гомер буена черү (τD, τR һәм тамчылар, рафтлар яки таплар өчен τP, тиешенчә, өстәмә рәсемне карагыз 8c) койрыкка туры килгән анализ һәм ике компонентлы черү моделе ярдәмендә алдык.Уртача τ τ дан.Күп экспоненциаль фитон өчен бик аз фотон җитештергән ROIлар анализдан чыгарылды.Кулланылган кисү <рафт һәм нокталар өчен 104 фотон, тамчылар өчен 103.Тамчыларның түбән бусагасы бар, чөнки югары интенсивлык кыйммәтләре белән черү кәкреләрен алу кыен, чөнки рәсем кырындагы тамчылар гадәттә кечерәк һәм аз.Фотон туплау чикләреннән арткан ROIлар (500 санау / пиксельгә куелган) анализ өчен дә ташландылар.Кызыклы төбәктән алынган интенсивлык бозылу сызыгын хезмәтнең башыннан максималь 90% интенсивлык белән (черүнең максималь интенсивлыгыннан соң) туры китерегез, минималь IRF комачаулавын тәэмин итү өчен, шул ук вакытта барлык интенсивлык бозылу өчен бер үк. көйләүләр Нисби вакыт тәрәзәсе рафтлар һәм таплар өчен 25 - 50 ROI, тамчылар өчен 15-25 ROI анализланды, ким дигәндә 3 бәйсез экспериментта язылган 4тән артык репликадан сайланган рәсемнәр.Ике койрыклы т-тестлар төрләр арасындагы яки коакерват системалары арасындагы статистик аерманы бәяләү өчен кулланылды.Гомернең (τ) пиксель-пиксель анализы өчен, һәр канал өчен кырның гомуми атенуациясе исәпләнде һәм 2/3 компонентлы экспоненциаль атенуация моделенең якынлашуы үткәрелде.Pixәр пиксель өчен гомер озынлыгы аннан соң исәпләнгән τ кыйммәтләр ярдәмендә урнаштырылды, нәтиҗәдә псевдок төсле FLIM туры килүче рәсем.Койрыкка туры килгән гомер диапазоны бер үк каналның барлык рәсемнәре буенча бер үк иде, һәм һәр черү ышанычлы фитон тәэмин итәр өчен җитәрлек фотоннар җитештерде.FRET анализы өчен пиксель 100 фотонның түбән интенсивлык чикләрен кулланып сайланды, бу уртача 11 фотонның фон сигналын (FBG).Channelәр каналның флюоресенция интенсивлыгы эксперименталь коррекция факторлары белән төзәтелде: 69 спектраль кроссталь 0,004, туры дулкынлану 0.0305, ачыклау эффективлыгы 0 0,517.Пиксель дәрәҗәсендәге FRET эффективлыгы аннары түбәндәге тигезләмә ярдәмендә исәпләнә:
монда FDD - донор (яшел) каналда күзәтелгән флуоресцентлык интенсивлыгы, FDA - турыдан-туры дулкынлану вакытында кабул итүче (кызыл) каналда күзәтелгән флуоресцентлык интенсивлыгы, һәм FAA - туры дулкынлану астында кабул итүче (кызыл) каналда күзәтелгән флюоресенция интенсивлыгы ( PIE).Флуоресцент интенсивлык импульслары каналда күзәтелә).
100 µл LLPS реакция эремәләрен 25 µM язылмаган мономерик Tau441 (25 µM αS белән яки аннан башка) LLPS буферына урнаштырыгыз (өстә күрсәтелгәнчә тулыландырыла) 96 кое микроплитасына ябыштыргыч фольга каплавы һәм тамчы формалашуы WF микроскопиясе белән тикшерелгәннән соң. тигезлек.10 минут эчендә.Бүлмә температурасында 48 сәгать инкубациядән соң, протеин рафтлары һәм таплар барлыгы расланды.Аннары скважиналар өстендәге сыеклыкны яхшылап алыгыз, аннары 50 L диссоциация буферы (10 мм HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 мм DTT) кушыгыз һәм 10 минут инкубацияләгез.Тозның югары концентрациясе LLPS калдык PEG аркасында кабатланмавын тәэмин итә, һәм электростатик үзара бәйләнештә барлыкка килгән протеин җыюлары сүтеләчәк.Аннары кое төбе микропипетта белән яхшылап кырылган һәм барлыкка килгән чишелеш буш күзәтү коесына күчерелгән.50 μM ThT белән үрнәкләр инкубацияләнгәннән соң, изоляцияләнгән тапларның булуы WF микроскопиясе белән тикшерелде.Соникатланган αS фибрилларын pH 7,4 белән 70 µM αS эремәсенең 300 µл инкубацияләп, 7 ° C натрий азиды 0,01% һәм орбиталь салгычта 200 әйләнеш белән әзерләгез.Аннан соң чишелеш 9600 × г 30 минутта центрификацияләнде, пелет pH 7.4 реанимацияләнде һәм соникатланды (1 минут, 50% цикл, Vibra-Cell VC130 соникаторында 80% амплитуда, Соникс, Ньютон, АКШ) фибрил үрнәкләре. кечкенә фибрилларның чагыштырмача бертөрле зурлыгы белән.
FCS / FCCS анализы һәм ике төсле очраклы очракны ачыклау (TCCD) PIE режимы ярдәмендә FLIM-FRET микроскопия экспериментлары өчен кулланылган MT200 вакыт белән чишелгән флуоресцент конокаль микроскопта (Пико-Квант, Берлин, Германия) башкарылды.Бу экспериментлар өчен лазер көче 6.0 µW (481 nm) һәм 6.2 µW (637 nm) өстәлде.Бу лазер көченең комбинациясе оптималь санау ставкаларына ирешкәндә һәм фотоблечинг һәм туенудан сакланганда кулланылган парлы флюорфорлар өчен охшаш яктылык тудыру өчен сайланган.Мәгълүмат җыю һәм анализ коммерциядә булган SymphoTime64 версиясе 2.3 программа ярдәмендә башкарылды (PicoQuant, Берлин, Германия).
LLPS ярдәмендә алынган изоляцияләнгән αS / Tau агрегатларының үрнәкләре изоляция буферында тиешле мономолекуляр концентрациягә эретелә (гадәттә 1: 500 эретү, чөнки агрегатлар коакерват үрнәкләреннән аерылганда аз концентрациядә).Samрнәкләр 1 мг / мл концентрациясендә BSA эремәсе белән алдан ясалган каплагычларга (Корнинг, АКШ) кулланылды.
Яшел һәм кызыл каналларда PIE-smFRET анализы өчен, мономерик вакыйгалар аркасында килеп чыккан түбән интенсивлык сигналларын фильтрлау өчен 25 фотонның түбән интенсивлык бусагасы кулланылды (мономерлар изоляцияләнгән агрегатлар белән чагыштырганда агрегатланган үрнәкләрдән күбрәк).Бу бусага саф мономер үрнәкләрен анализлаудан алынган мономерик αSның уртача интенсивлыгыннан биш тапкыр исәпләнде, анализ өчен агрегатларны махсус сайлау өчен.PIE саклагыч схемасы, TSCPC мәгълүмат туплау белән берлектә, фонны һәм спектраль кросстальне бетерергә ярдәм итүче гомерлек авырлык фильтрын кулланырга мөмкинлек бирде.Aboveгарыдагы бусагадан файдаланып сайланган ялкын интенсивлыгы, буфер үрнәкләренең интенсивлыгы / бинасы белән булган вакыйгалар гистограммаларыннан билгеләнгән уртача фон сигналы ярдәмендә төзәтелде.Зур агрегатлар белән бәйләнгән шартлаулар гадәттә вакыт эзендә берничә рәтне били (1 мс итеп куелган).Бу очракларда максималь көч савыты сайланды.ФРЕТ һәм стохиометрик анализ өчен теоретик яктан билгеләнгән гамма фактор γ (0.517) кулланылды.Спектраль кроссталь һәм туры дулкынландыру кертемнәре кулланылган дулкынландыргыч лазер көчендә бик аз (эксперименталь рәвештә билгеләнә).Шартлауда ФРЕТның эффективлыгы һәм стохиометриясе түбәндәгечә исәпләнә.