347 дат басмас корычтан торбаланган химик компонент, үзара бәйләнгән масса спектрометрия (CLMS) ярдәмендә роман интерферон-реакцияле кеше лейкоцит антиген-А (HLA-A) шаперон белгечләрен ачыклау.

Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт.Сез чикләнгән CSS ярдәме белән браузер версиясен кулланасыз.Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та туры килү режимын сүндерегез).Моннан тыш, дәвамлы ярдәмне тәэмин итү өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәбез.
Слайдка өч мәкалә күрсәтүче слайдерлар.Слайдлар аша хәрәкәт итү өчен арткы һәм киләсе төймәләрне кулланыгыз, яки һәр слайд аша хәрәкәт итү өчен ахырдагы слайд контроллер төймәләрен кулланыгыз.

Җитештермә тасвирламасы

Датсыз корыч 347L кәтүк трубалары, корыч класс: SS347L

Интерферон сигнализация системасы әйләнә-тирә мохитнең патогеник һәм эчке патологик сигналларына көчле цитокин реакциясен китерә, нәтиҗәдә интерферон-индуктив булмаган аксымнар индуктивлыгы барлыкка килә.Интерферон-протеиннар доменында яңа протеин-протеинның үзара бәйләнешен ачыклау өчен без DSS-арадаш кросс-масса спектрометриясен (CLMS) кулландык.Көтелгән интерферон-индуктив протеиннарга өстәп, без шулай ук ​​MX1, USP18, OAS3, STAT1 кебек каноник интерферон-индуктив протеиннарның роман интермолекуляр һәм күзәнәкара бәйләнешле кушылмаларын ачыкладык.Без HLA-A белгечләре (H2BFS-HLA-A-HMGA1) формалашкан интерферон-индуктив белок челтәрләренең роман җыелмасын оргональ тикшерүгә юнәлдек, молекуляр динамика модельләштерү ярдәмендә алга таба өйрәнү.Протеин комплексының конформацион динамикасын модельләштерү берничә үзара бәйләнешле сайтны ачты, алар CLMS табышмакларында күрсәтелгән үзара бәйләнешне чагылдырдылар.Бергәләп, без интерферон китереп чыгарган яңа сигнал комплексларын ачыклау өчен CLMS пилот тикшерүен тәкъдим итәбез, һәм шеш микроэнергетикасында белок үзара бәйләнешнең яңа динамикасын ачыклау өчен CLMS киңрәк куллануны түземсезлек белән көтәбез.
Адаптив иммун реакция башланганчы, хуҗаның тумыштан саклану системасы антимикробиаль җавапны урнаштыра, интерфероннар (IFNs) дип аталган яшерен альфа-гелик цитокиннар гаиләсе белән арадашлаша.I IFN класслары IFNα һәм IFNβ кәрәзле реакцияләрне активлаштыралар, шул исәптән вирус, проапоптотик, профинформатик һәм антипролифератив хәлләр.Кешеләрдә IFNαның 13 төре билгеле, барысы да хромосомада кластерланган 91. Гаҗәп, клиник куллану өчен IFNα2 гына өйрәнелгән.Күптән түгел IFNαның башка төрләре буенча тикшеренүләргә аеруча игътибар бирелде.Күптән түгел үткәрелгән тикшерү күрсәткәнчә, IFNα14 HBV2 һәм ВИЧ-13,4 репликасын чикләүдә иң эффектив изоформаларның берсе, каноник IFNα2 тибы белән чагыштырганда.
Билгеле булганча, I интерферон рецептор комплекслары активлашкан (IFNAR1 һәм IFNAR2) TYK2 һәм JAK15,6 Янус киназалары арадашлашкан сигнал трансдуктив каскадын эшләтеп җибәрә.Бу Янус кинослары фосфорилат сигнал трансдуктерлары һәм транскрипцияле протеин активлаштыручылары (STAT1 һәм STAT2) тиросин калдыкларында SH2 домен-арадашлы гетеродимизацияне башлау өчен6.Соңыннан, IRF9 STAT гетеродимерларын бәйли, IFN-стимуллаштырылган фактор 3 генның (ISGF3) тримерик комплексын формалаштыра, ул ядрәгә күчерелә һәм 2000-дән артык интерферон-стимуллаштырылган ген (ISG) транскрипциясен китерә.
ISGлар тумыштан килгән иммун системасының арка сөяген тәшкил итә, аеруча вируслы һөҗүмгә җавап итеп.Вируслы инфекциядән саклануның беренче сызыгы буларак, күзәнәкләр кәрәзле протеиннарның киң биологик эшчәнлеге белән тиз арада үзара бәйләнешләрен урнаштыралар.Бу протеиннарга үрнәк тану рецепторлары, сигнал молекулалары, транскрипция факторлары, туры вируслы функцияләре булган протеиннар, шулай ук ​​иммун реакцияләрнең тискәре көйләүчеләре керә9.ISG эшчәнлеге турында күпчелек мәгълүмат функциональ экраннардан килә, 10,11 яки ген сүндерү техникасы (siRNA, RNAi һәм CRISPR) 12,13, аларда аерым ISG'лар күрсәтелә яки тыела һәм аларның эшчәнлеге төрле вирусларда сынала.Бу тикшеренүләр аерым ISGларның вируска каршы үзлекләрен билгеләсәләр дә, һәр ISG-ның төп молекуляр механизмнары билгеле түгел.Күпчелек белгечләр тулы активлыкны тәэмин итү өчен бер яки берничә цитокин белән үзара бәйләнештә булулары кабул ителә, шуңа күрә ISGлар турыдан-туры үзара бәйләнештә торалар, яки үзара бәйләнешләре кәрәзле протеиннар белән арадашлашалар.Мәсәлән, күптән түгел фотокросска бәйләнгән протеомика тикшерүе ATPase VCP / p97ны IFITM3 үзара бәйләнеш партнеры итеп билгеләде, аның тыелуы лизосомаль сортлау, әйләнеш һәм IFITM3 вируслы кисәкчәләр белән котранспорт кимчелекләренә китерә.Иммунопрекипитация кулланып, без весикула белән бәйле протеин VAPAны IFITM1 / 2/3 белән үзара бәйләнеш партнеры итеп билгеләдек, бу холестерин-вируслы җитлеккәнлекне арадашлый, һәм бу чүпрә ике гибрид система ярдәмендә бүтән тикшерү белән расланды.Фәнни ярдәм 15, 16.
Инфекцияне һәм яман трансформацияне бастыруда катнашкан төп биологик процесс - антиген презентациясе, ул төп гистокомплекатив комплекс (MHC) молекулалары белән арадашлаша.Пептидлар (озынлыгы 8-12 аминокислоталар) ярылган, вакытыннан алда беткән яки үзгәртелмәгән аксымнар MHC-I гетеродимерына (MHC-I авыр һәм җиңел чылбырлардан тора, β-2-микроглобулин; β2M) 17,18.Нәтиҗә ясалган тотрыклы MHC-I тримерлары күзәнәк өслегенә ташыла, алар CD8 + T күзәнәкләренә күзәнәк цитотоксик пептидлар (цитотоксик Т күзәнәкләре) 17.Т күзәнәкләре бу патогеннарны һәм шешкә хас антиген йөртүче күзәнәкләрне таныйлар һәм юк итәләр.Димәк, патогеннар һәм шеш күзәнәкләре иммун күзәтүдән саклану өчен еш антиген презентация процессын бастыралар.Моннан тыш, MHC-I кеше шешләренең 40-90% тәшкил итә һәм начаррак прогноз белән бәйле19.
Патогеннарга җавап бирүдә катнашкан геннар тиз арада ял итү һәм актив транскрипция торышы арасында күчәргә тиеш.Шуңа күрә, берничә кәрәзле протеин кыска вакыт эчендә югары IFN таләпләренә җавап бирүдә катнашу өчен гипотезага салынган, шул исәптән 20,21 промоутер хроматинын ремонтлау һәм модификацияләү.Күпчелек тикшеренүләр IFN булганда аерым ISG белок партнерларын ачыклауга юнәлтелгән.Модель күзәнәк системаларында берничә протеомик һәм транскриптомик тикшеренүләр IFNның кәрәзле ландшафтка тәэсирен ачыкладылар.Ләкин, интерфероннар китергән динамиканы аңлауга карамастан, без ISG-ларның катнашуы турында аз беләбез.Интерферон сигнализациясенең катлаулылыгын һәм вакытка бәйле динамикасын исәпкә алганда, ике сорау туа: (i) тиз сигнализациядә катнашкан мультипротеин комплексларны тотрыклыландырырга һәм капларга мөмкинме, һәм (ii) бу үзара бәйләнешне 3D космоска күчереп буламы?
Бу проблемаларны чишү өчен, без IFNα китергән протеинның үзара бәйләнеш челтәрен һәм аның динамикасын өйрәнү өчен масса спектрометрия (CLMS) белән кушылган диссинимид суберат-арадаш химик үзара бәйләнешне (DSS) тормышка ашырдык.DSS белгечләрнең проксималь калдыклары һәм / яки протеин комплекслары арасында ковалент бәйләнешләр өсти.Соңгы MS анализы, үзара бәйләнеш дип аталган, яки протеин комплексларындагы субуниталар, үзара бәйләнеш дип аталган, билгеле бер протеин эчендәге төбәкләрнең киңлек якынлыгын чагылдырган махсус үзара бәйләнешле сайтларны ачыклый.Бу ысулны кулланып, без берничә яңа протеин-протеин комплексларын, шулай ук ​​интерферон-индуктив мультипротеин үзара бәйләнеш челтәрләрен ачыкладык.Алга таба бу яңа үзара бәйләнешнең бер өлешен сынап, без H2BFS (H2B гистон тибындагы FS; алга таба H2B дип атала) һәм MDN1 HLA-A өчен мәҗбүри партнер булып эшләвен күрсәтәбез.
Flo-1 күзәнәкләре - үзофагаль аденокарциноманың витро модельләренең берсе, чөнки алар үзофагаль шешләрнең төп үзенчәлекләрен охшаталар22,23.Ләкин, барлык шешләр дә иммуноген түгел, һәм Flo-1 күзәнәкләренең интерферон дәвалауга җавап биргәнен ачыклау өчен, без Flo-1 күзәнәкләрен 10 ng / ml IFNα белән 72 сәгать дәваладык.Flo-1 күзәнәкләре pSTAT1 һәм IRF1 индукциясен күрсәттеләр, дәваланганнан соң 2 сәгатьтән башлап, IRF1 стационар дәрәҗәләренең вакытка бәйле кимүе белән 72 сәгать дәвам иттеләр.ISGs (MX1, IFITM1, OAS1 / 2, һәм ISG15) 6 сәгатьтән соң көчле этәргеч табылды, IFNα классик урта һәм соңрак фаза реакцияләрен охшатып (1А рәсем).Бергәләп, бу мәгълүматлар бу кәрәзле модельнең интерферон җавапларын өйрәнү өчен кулланылырга мөмкинлеген күрсәтә.
IFNα дәвалаганнан соң Flo-1 күзәнәкләрендә дифференциаль белок белдерү җаваплары.А) 2, 6, 24, 48 һәм 72 сәгать эчендә 10 нг / мл IFNα белән эшкәртелгән Flo-1 күзәнәкләрендә протеиннарның чагылышы иммуноблот белән күрсәтелгән ISG антителалары ярдәмендә анализланган.(B) Coomassie зәңгәр төсле SDS-PAGE гельләре, күрсәтелгән вакытлар һәм концентрацияләр өчен DSS белән үзара бәйләнгәннән соң, бөтен күзәнәк экстрактларының гельләре.(C) Вәкил иммуноблот протеинның үзара бәйләнеш дәрәҗәсен бәяләү өчен шул ук үрнәкләрдән p53 (DO-1) антителасы белән тикшерелде.
Ситу протеинының үзара бәйләнеш пейзажын алу өчен, без мембрананың үткәрүчәнлеге һәм чагыштырмача кыска реакция вакыты аркасында киң кулланылган үзара бәйләүче агент DSS кулландык.Кыска реакция вакыты үзара бәйләнгән аксымнарның зур агрегатларын булдырмаска ярдәм итә, шуның белән кросс-линкерның тотрыклылыгын саклый.Оптималь DSS концентрациясен ачыклау һәм үзара бәйләнештән саклану өчен, без башта 5, 2,5, һәм 1 мм DSS күзәнәкләрен 5, 10, 5, һәм 30 минут эчендә ачтык, һәм Coomassie-буялган SDS-PAGE лизаталарын анализладык. (мәгълүматлар күрсәтелмәгән).Күзәнәк лизатлары иң түбән концентрациядә һәм иң кыска вакыт эчендә бик үзара бәйләнгән булып күренә.Шуңа күрә, DSS 5 минут эчендә 1, 0,5, һәм 0,1 мм титирланган (1Б рәсем).Оптималь үзара бәйләнеш 0,5 мм DSS белән 5 минут эчендә күзәтелде, һәм бу шартлар IFNα белән эшкәртелгән күзәнәкләр өчен сайланды.Моннан тыш, 1C рәсемдә протеинның үзара бәйләнеш дәрәҗәсен бәяләү өчен p53 (DO-1) антителасы ярдәмендә башкарылган Көнбатыш блот күрсәтелә.
Flo-1 күзәнәкләре 10 нг / мл IFNα белән 24 сәгать эшкәртелде, кросс-линкерны өстәгәнче.Соңрак үзара бәйләнгән күзәнәкләр ике этаплы протеолиз белән лизизацияләнде һәм протеиннар FASP белән эшкәртелде (2 нче рәсем) 24,25.Crossзара бәйләнгән триптик пептидлар масса спектрометрия белән анализланган (2 нче рәсем).Аннары MS / MS спектры протеин эзлеклелегенә туры килә һәм MaxQuant26,27 белән күләмләнә.Сим-XL программасы ярдәмендә алынган спектрлардан үзара бәйләнгән пептидлар ачыкланды, һәм аерым кушылмалар xQuest28 һәм SIM-XL29 ачык чыганак исәпләү программалары торбалары ярдәмендә катлаулы челтәргә кушылды (2 нче рәсем).SIM-XL гади яки катлаулы протеин катнашмаларында протеин-протеинның үзара бәйләнешен, эчке чылбырларын һәм аерым чылбырларын ачыклый һәм протеин структураларында үзара бәйләнешне күзаллау өчен сценарийлар бирә.Моннан тыш, ул MS / MS29 спектр сыйфаты буенча ID-балл буларак һәр кросс-белешмәлекне урнаштыра.Берничә ышанычлы протеин-протеинның үзара бәйләнеше һәм комплекслары ачыкланды, һәм үзара бәйләнешнең яңа җыелмасы алга таба ко-иммунопрекипитация һәм молекуляр динамика (MD) модельләштерү ярдәмендә комплексларның конформацион үзгәреше ярдәмендә тикшерелде (2 нче рәсем) 30, 31.
CLMS ысулына схематик күзәтү.Flo-1 күзәнәкләре 10 нг / мл IFNα белән 24 сәгать эшкәртелде, аннары ситу протеины DSS ярдәмендә үзара бәйләнештә, аннары күзәнәк лизиясе һәм трипсинизация.Crossзара бәйләнгән үрнәкләр Орбитрап масса спектрометры ярдәмендә анализланды һәм LC-MS / MS вакытында пептид прекурсорларын фрагментлау өчен үрнәк алына.Ике бәйләнгән пептид үзара бәйләнгән пептидларның спектрын тану машинасы (SIM-XL) ярдәмендә алынган спектрлардан ачыкланды, һәм барлык кушылмалар исәпләү торбалары ярдәмендә катлаулы челтәргә кушылды.Ялган позитив ставка (FDR) баллларына нигезләнеп түбән ышаныч үзара бәйләнешне фильтрлагыз.Берничә яңа югары ышанычлы протеин-протеин үзара тәэсир итү ко-иммунопрекипитация ярдәмендә тагын да расланды, һәм комплекслардагы конформацион үзгәрешләр молекуляр динамика (MD) модельләштерү ярдәмендә тикшерелде.
MaxQuant ярдәмендә стимуллашмаган һәм стимуллаштырылган IFNα үрнәкләрендә барлыгы, 500 30,500 һәм, 5 28,500 пептидлар табылды (өстәмә таблица S1, рәсем 3A).Ике очракта да пептид озынлыгы бүленеше зуррак пептидларның зур өлешен күрсәтте, үзара бәйләнгән пептидларның булуын күрсәтә (3Б, С).Моннан тыш, IFNα белән эшкәртелгән үрнәкләрдә 40-55 диапазонында зуррак пептидларның зур өлеше булган (3C рәсем).Протеиннарны log2 интенсивлыгына каршы күрсәтү классик интерферон-стимуллаштырылган протеиннарның эшкәртелмәгән үрнәкләр белән чагыштырганда иң күп булуын күрсәтте, шул исәптән MX1, IFIT1 / 3, OAS2 / 3, DDX58, һәм HLA-F (3D рәсем).Белгечләр өчен юлларны анализлау, Reactome юл базасы ярдәмендә IFNα эшкәртүенә җавап итеп, өч тапкыр баетылган, MHC-I-арадаш антиген презентациясе һәм эшкәртү иң доминант юл булганын күрсәтте (3E рәсем).Элеккеге докладлар белән эзлекле, OAS һәм ISG15 арадашлашкан вируслы җаваплар, шулай ук ​​IFNα / β һәм цитокин сигнализациясе активлашкан юллар арасында иде.Моннан тыш, лизин һәм серинга хас булган протеинның үзара бәйләнеше SIM-XL ярдәмендә башта алынган MS / MS спектрыннан ачыкланган.Күптән түгел үткәрелгән тикшерү 104 ISG'ның 9 вирус классыннан 20 вирусны үз эченә алганын хәбәр итте, 5 күзәнәк тибындагы аерым ISG чиктән тыш кысу тикшеренүләрен мета-анализлау9.Ләкин, зур мәгълүматлар базасын скринклауның исәпләү чикләрен җиңәр өчен, без кечерәк мәгълүматлар базасы белән Падария һ.б. хәбәр иткән IRDS геннары исемлеге арасындагы мөмкин үзара бәйләнешне тикшерү өчен башладык, аларның күбесе ISGлар.
IFNαга җавап итеп дифференциаль рәвештә күрсәтелгән үзара бәйләнгән аксымнарны ачыклау (MaxQuant-дан алынган мәгълүматлар).А) IFNα14 эшкәртелгән һәм эшкәртелмәгән Flo-1 үрнәкләрендә ачыкланган гомуми һәм эксклюзив пептидлар санын күрсәтүче Вен схемасы.Пептид озынлыгы эшкәртелмәгән (B) һәм IFNα эшкәртелгән (C) үзара бәйләнгән үрнәкләрне тарату.(D) Тазартылмаган һәм IFNα14 эшкәртелгән Flo-1 күзәнәкләре арасында log2 (LFQ интенсивлыгын) күрсәтүче җылылык картасы.Сул панельдә IFNα булганда иң актив булган аксымнар күрсәтелә.(E) Гистограмма IFNα белән эшкәртелгәннән соң 20 төп баету юлын күрсәтә.Reactome юллар базасы IFNα-реакцияле протеиннарның дүрт тапкыр үзгәрүен анализлады.
Интерферон-арадаш ISG стимуляциясе яхшы документлаштырылган, ләкин молекуляр дәрәҗәдә бу протеиннарның биологик функцияләрнең ничек киң таралуы начар аңлашыла.Билгеле ISGлар арасында югары дәрәҗәдәге ышаныч белән протеинның үзара бәйләнешен тикшердек.Кызык, без IFNα дәвалауга җавап итеп зур комплекс формалаштыручы MX1, USP18, ROBO1, OAS3, һәм STAT1 белгечләрен кертеп, челтәрне ачыкладык (4 нче рәсем, S2 таблицасы) 32,33,34.Иң мөһиме, бу үзара бәйләнеш IFNα белән эшкәртелгән барлык өчпочмакларда табылды һәм эшкәртелмәгән үрнәкләрдә табылмады, бу аларның IFNα дәвалауына җавап итеп формалашканын күрсәтә.Билгеле булганча, STAT1 транскрипцияле бу ISG'ларның экспрессиясен көйли, ләкин аның протеин дәрәҗәсендә ISG белән үзара бәйләнеше өйрәнелмәгән.STAT1 кристалл структурасы аның гелик доменының (CCD) үлчәмнәр формалашу вакытында ДНК яки протомерлар белән үзара бәйләнештә катнашмавын күрсәтте35.Бу α-шакмаклар гелик геликс структурасын формалаштыралар, алар үзара бәйләнеш өчен гидрофилик өслек мәйданын тәэмин итә 35.Безнең CLMS мәгълүматларында без STAT1 белән үзара бәйләнешнең күбесенең SH2 доменында КДС, бәйләүче домен яки C-терминал койрыгы (700-708 калдыклары) булганын күрдек (4A рәсем).Элеккеге тикшерү хәбәр иткәнчә, USP18 STD2нең КД һәм ДНК бәйләүче доменына (DBD) бәйләнә һәм I интерферон рецепторы IFNAR2 субунитасына I интерферон сигнализациясе 24 тибындагы тыюны арадаш итү өчен җәлеп ителә.Безнең мәгълүматлар шулай ук ​​USP18 катализатор доменының STAT1 DBD (4A, D) белән үзара бәйләнештә булуын күрсәттеләр, бу STAT1 һәм STAT2ның USP18 IFNAR2 җәлеп итүдә роль уйный алуын күрсәтә.
Протеин-протеин ISG челтәре IFNα белән эшкәртелгән үзара бәйләнгән күзәнәкләрдә ачыкланган.(А) 2D үзара бәйләнеш сюжеты, протеин-протеинның үзара бәйләнешен күрсәтә (SIM-XL программасында барлыкка килә), интермолекуляр үзара бәйләнешне күрсәтүче сызыклар белән (үзара бәйләнеш 3,5 итеп куелган).Төрле идентификация доменнары аларның төсе белән билгеләнә32: MX1 домены, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), һәм GED (569–660).OAS3 доменнары: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), һәм OAS1_C (903-108).ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) һәм fn3 (777–864).STAT1 кырлары: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), һәм STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Бер-берсенә бәйләнгән аксымнарның түгәрәк тамашачысы (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, һәм STAT1), зәңгәр һәм кызыл төстә язылган үзара бәйләнешләр һәм үзара бәйләнешләр белән.Crossзара бәйләнеш бусагасы 3,5 итеп билгеләнде.Нокта участоклары MAT1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), һәм OAS3 (F) белән STAT1 үзара бәйләнеш мәйданнарын, шулай ук ​​ике пептид арасындагы K яки S үзара бәйләнеш мәйданнарын күрсәтәләр.Рәсемдә, үзара бәйләнешле балл бусагасы 3.0 итеп куелган.)STAT1 (pdb id: 1bf533) һәм OAS3 (pdb id: 4s3n34).) программасы.
USP18-ның ике изоформасы кешеләрдә тасвирланган, тулы озынлыктагы протеин, нигездә, ядрода урнашкан, һәм N-терминал домены булмаган изоформа, USP18-sf, цитоплазмада һәм 36 үзәктә тигез таралган.Моннан тыш, N-терминус структурасыз булыр дип фаразланган һәм изопептида активлыгын яки ISG1537 бәйләнешен таләп итми.Безнең тикшерүдә ачыкланган күпчелек үзара бәйләнеш протеинның N-терминусында урнашкан, бу үзара тәэсир итү тулы озынлыктагы USP18 (рәсем 4A, D) һәм шулай итеп ядрода булырга мөмкинлеген күрсәтә.Моннан тыш, безнең мәгълүматлар шулай ук ​​N-терминусның протеин-протеин үзара бәйләнеше өчен махсуслашканын күрсәтәләр.IFNAR2 бәйләү мәйданы 312-368 калдыклары арасында урнашкан, һәм аеруча, комплекстагы протеиннарның берсе дә бу төбәккә бәйләнми (4A рәсем) 37,38.Бергә тупланган бу мәгълүматлар IFNAR2 бәйләүче доменның рецептор протеины белән генә кулланылуын күрсәтә.Моннан тыш, OAS3 һәм ROBO1 гына N-терминус һәм IFNAR2 бәйләү мәйданының югары агымындагы доменнар белән бәйләнгән дип табылды (4A рәсем).
ROBO1 трансмембрана сигнал молекулаларының иммуноглобулин (Ig) суперфамилиясенә керә һәм биш Ig доменыннан һәм күзәнәктән тыш төбәктә өч фибронектин (Fn) доменыннан тора.Бу күзәнәктән тыш доменнар мембрана-проксималь регион һәм бер трансмембрана геликс белән иярәләр 39. Структур булмаган күзәнәкләр төбәге C-терминалда урнашкан һәм сакланган эзлеклелек мотивларын үз эченә ала.Аминокислоталардан 00 1100 дән 1600гә кадәр сузылган төбәк күбесенчә тәртипсез.Без таптык, MX1 ROBO1 белән Ig, Fn, һәм күзәнәкләр эчендәге доменнар аша үзара бәйләнештә тора, STAT1 белән күпчелек үзара бәйләнеш аның КДС, бәйләүче домен һәм ROBO1 C-терминалы арасында була (4A, E).Икенче яктан, DI, DIII, OAS3 бәйләүче төбәкләр белән үзара бәйләнеш ROBO1 протеины буенча таратылды (4A рәсем).
Олигоаденилат синтаз (OAS) протеиннар гаиләсе күзәнәкле ике катлы РНКны (dsRNA) кабул итә һәм бәйли, конформацион үзгәрешләр кичерә һәм 2 ′, 5′ бәйләнгән олигоаденилатлар синтезлый (2-5 As) 40.Өч OAS арасында OAS3 dsRNA өчен иң югары якынлыкны күрсәтә һәм иң аз күләмдә 2-5 As синтезлый, бу RNase Lны активлаштыра һәм шуның белән вируслы репликацияне чикли 41.OAS гаиләсе полимераз бета (пол-β) охшаган нуклеотид трансфераз доменнарыннан тора.Элеккеге тикшеренүләр күрсәткәнчә, C-терминал доменының (DIII) катализатор активлыгы OAS342 активлаштыру өчен кирәк булган dsRNA бәйләүче доменга (DI) бәйле.Без OAS3 DI һәм DII доменнары КДС һәм SH2 белән STAT1 TAD арасында кечкенә тоташу өлкәсе белән үзара бәйләнештә торуларын күрдек (4A, F).Протеин структурасында төрле үзара бәйләнешле сайтларны каплау β-таблица һәм DBD STAT1 циклы белән OAS3 DI доменында 60-75 калдыклар белән барлыкка килгән ачык кесә яки куыш арасындагы үзара бәйләнешне күрсәтте (4G рәсем).Белгечләрнең комплекстагы юнәлеше шулай ук ​​күрсәтте, OAS3 белән үзара бәйләнешнең берсе дә аның DI доменының ДНК бәйләү сәләтенә комачауламады (S1A рәсем).Моннан тыш, GTPase MX1 N-терминалы домены OAS3 DI һәм DIII доменнары белән бик нык бәйләнештә тора (4A рәсем).Без шулай ук ​​OAS1 һәм MX1 арасындагы үзара бәйләнешне күзәттек, IFNα белән эшкәртелгән өч кабатлауда, бер OAS1 домены (шулай ук ​​катализатор актив) өч MX1 домены белән үзара бәйләнештә (S2A, B рәсем).
MX белгечләре динеинга охшаган GTPases зур гаиләсенең бер өлеше, аларда N-терминалы GTPase домены бар, ул GTP-ны бәйли һәм гидролизлый, үз-үзен җыюны арадаш итүче арадаш домен, һәм GTPase (LZ) ролен башкаручы C-терминал лейцин фермеры. ).домен эффектор домен25,43.MX1 вируслы полимераз субуниталарына бәйләнә, вируслы ген транскрипциясен блоклый.Элегерәк хәбәр ителгән чүпрә ике гибрид экран күрсәткәнчә, PIAS1 белән бәйле MX1 STAT1-арадашлы ген активлаштыруны тыя, ДНК бәйләүче эшчәнлекне блоклый һәм шулай ук ​​SUMO E344,45 лигаз активлыгы бар.Монда, без MX1 STAT1 белән бәйләнгәнен күрсәтәбез (рәсем 4C, D), ләкин бу үзара бәйләнеш IFNαга җавап итеп STAT1-арадашлы ген активлашуга ничек тәэсир итә, алга таба өйрәнү кирәк.Моннан тыш, без шулай ук ​​таптык, MX1 IFIT3 һәм DDX60 белән IFNα белән эшкәртелгән өч кабатлауда (S2C рәсем).
DDX60 - IFN китергән цитоплазмик геликаз, моңа кадәр RIG-I-вируслы RNA46-ның бәйсез деградациясендә роль уйнаганы турында хәбәр ителгән.Ул RIG-I белән үзара бәйләнештә тора һәм сигналын лиганд-специаль рәвештә активлаштыра 46. DDX60 DEXD / H-Box геликаз доменыннан һәм вируслы RNA һәм DNA47 бәйләүче C-терминал геликаз доменыннан тора.Аның MX1 һәм IFIT3 белән үзара бәйләнешенең күбесе озын N- һәм C-терминал өлкәләрендә, каноник доменнар яки мотивларсыз була (S2E, F).Ләкин, MX1 шулай ук ​​DEXD / H-Box геликаз домены белән бәйләнгән (S2E рәсем).IFIT гаиләсенең протеиннарында тетрапептид кабатлау (TPR) дип аталган үзенчәлекле геликс-борылыш-геликс мотивының тандем күчермәләре бар.IFIT3 RIG-I сигнализациясенең уңай модульаторы һәм шунлыктан MAVS комплексының компоненты дип табылды.Бергә тупланганнан соң, безнең мәгълүматлар IFIT3 һәм DDX60, беренче чиратта, TPIT 3–6 арасында IFIT3 арасында үзара бәйләнештә торуларын күрсәтәләр һәм RIG-I / MAVS сигнализациясендә роль уйный алалар (S2F рәсем).
Барлык протеомны скринклау исәпләү интенсив булуын исәпкә алып, без IFNα белән эшләнгән кабатлауларның берсе булу өчен бөтен UniProt мәгълүмат базасын тикшердек.Бу репликада без HLA-A өчен берничә ышанычлы үзара бәйләнеш челтәрен таптык.MS / MS спектры белән билгеләнгән протеин юлларын анализлау күрсәткәнчә, MHC-I нигезендә антиген эшкәртү һәм презентация интерферон китергән төп юл (3D рәсем).Шуңа күрә, без барлык үзара бәйләнгән үрнәкләргә югары ышаныч белән MHC-I молекулаларының протеин үзара тәэсирен өйрәнүгә юнәлдек.HLA α1, α2 һәм α3 доменнардан һәм җиңел чылбырлардан тора, һәм микроглобулин β2 (β2м) - даими шаперон белок 49.Эндоплазмик ретикулумда җыелгач, HLA пептид лигандлары булмаганда тотрыксыз.Пептид бәйләүче трюк бик полиморфик һәм структурасыз α1 һәм α2 доменнары белән пептид булмаган формада һәм чагыштырмача аз полиморфик α351 доменында барлыкка килә.IFNα булганда, без ике HLA-A комплексын ачыкладык: берсе HMGA1 һәм H2B (5 нче рәсем, таблица S3), икенчесе MDN1, LRCH4 һәм H2B белән үзара бәйләнештә (6 нчы рәсем).
IFNα H2B (H2BFS) һәм HMGA1 белән үзара бәйләнеш челтәрен китерә.(А) 2D сюжеты (SIM-XL программасында ясалган) H2B-HLA-A-HMGA1 комплексындагы төрле үзара бәйләнешне сурәтләгән: үзара бәйләнеш (зәңгәр), үзара бәйләнеш (кызыл) һәм бер сылтама (кара)..Төрле идентификация доменнары төсле кодланган32: H2B (гистон; 2-102) һәм MHC-I (MHC_1; 25–203, C1 төркеме; 210–290 һәм MHC_I_C; 337–364).Crossзара бәйләнеш бусагасы 3,5 итеп билгеләнде.Нокта участоклары HLAB-ның H2B (B) һәм HMGA1 (C) белән үзара бәйләнеш мәйданнарын, шулай ук ​​ике пептид арасындагы K яки S үзара бәйләнеш мәйданнарын күрсәтәләр.Рәсемдә, үзара бәйләнешле балл бусагасы 3.0 итеп куелган.(D) PyMOL программасында H2B, HLA-A, HMGA1 белгечләре структураларында күрсәтелгән протеиннар арасындагы бәйләнеш.Бу структуралар Phyre2 серверы ярдәмендә модельләштерелгән (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) һәм H2B, HLA-A һәм HMGA1 протеиннары өчен шаблон структуралары тиешенчә 1kx552, 1kj349 һәм 2eze55 иде.
IFNα H2B (H2BFS), MDN1 һәм LRCH4 белән HLA-A үзара бәйләнеш челтәрен китерә.(А) 2D интерактив картада күрсәтелгән (SIM-XL программа тәэминатында ясалган) түгәрәк рәвешендә күрсәтелгән эчке (кызыл) һәм интермолекуляр (зәңгәр) кроссовкалар.Crossзара бәйләнеш бусагасы 3,5 итеп билгеләнде.Төрле идентификация доменнары төсле кодланган32: H2B (гистон; 2-102), MHC-I (MHC_1; 25–203, C1 төркеме; 210–290 һәм MHC_I_C; 337–364) һәм LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) һәм CH (535–641)).(B) PyMOL программасында H2B, HLA-A, LRCH4, MDN1 белгечләре структураларында күрсәтелгән протеиннар арасындагы бәйләнеш.Бу структуралар Phyre2 серверы (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ярдәмендә модельләштерелгән, H2B, HLA-A, LRCH4 һәм MDN1 аксымнары өчен 1kx552, 1kj349, 6hlu62 һәм 6i2665 шаблон структуралары белән, тиешенчә.H2B (C), LRCH4 (D), һәм MDN1 (E) белән HLA-A өчен K яки S үзара бәйләнеш мәйданнарын күрсәтүче нокта участоклары.Otsир кишәрлекләре өчен үзара бәйләнешле балл бусагасы 3.0 итеп билгеләнде.
Геномның бөтенлеген саклау белән беррәттән, H2B гистоны транскрипцияне көйләүдә дә катнаша.H2B протеины үзәк гистон доменыннан (HFD) тора, цикллар белән аерылган өч α-шакмак һәм C-терминал койрыгы 41,52.H2B белән үзара бәйләнешнең күпчелеге H1 геликсында була, ул HFD гетеродимеры белән тримеризацияне тәэмин итә (5A, B).Лизиннар ДНК бәйләүдә катнашсалар да, кайбер лизиннар шулай ук ​​альтернатив ацетиляция яки метиляция мәйданнары.Мәсәлән, H2B дан K43, K46, K57 калдыклары туры ДНК бәйләүдә катнашмыйлар, ләкин транскрипциядән соң төрле үзгәртүләр максаты53.Шулай ук, H2Bдагы K44, K47, K57 калдыклары IFNα булганда, башка протеиннар белән үзара бәйләнешне кертеп, альтернатив роль уйный алалар (5A рәсем, В).Моннан тыш, H2B экстрахромосомаль гистон төрле күзәнәк типларында иммун реакцияне активлаштыра, йогышлы агентлардан яки зарарланган күзәнәкләрдән алынган ике катлы ДНК (dsDNA) фрагментларын ачыклау өчен цитосолик сенсор булып эшли.ДНК вируслары булганда, H2B тузуы IFN-β җитештерүне һәм STAT154 фосфориляциясен тоткарлады.H2B шулай ук ​​башка үзәк гистоннарга караганда тизрәк ядрәгә кереп чыга.MDN1 һәм LRCH4 белән H2B үзара бәйләнеше шулай ук ​​сайланган эшкәртелмәгән үрнәкләрдә күзәтелде.Без HLA-Aның H2B белән IFNα белән эшкәртелгән өч үрнәктә дә, бер дәваланмаган кабатлау үрнәгендә дә үзара бәйләнештә булуын таптык.Бу мәгълүматлар транскрипцияле көйләүдән бәйсез альтернатив физиологик функциядә H2B ролен чагылдыра.
HMGA1 (югары хәрәкәтчәнлек төркеме AT-Hook 1), кечкенә нуклеопротеин, авыруны пропагандалаучы аминокислоталарга бай, HLA-A белән берлектә ачыкланган.Аның кислоталы C-терминалы койрыгы һәм өч төрле DBD бар, алар AT калькалары дип атала, чөнки алар dsDNA55,56-да AT-бай төбәкнең кечкенә трюкларына бәйләнәләр.Бу бәйләү ДНКның иелүенә яки туры килүенә китерә, каноник транскрипция факторларына аның консенсус эзлеклелегенә керергә мөмкинлек бирә.С-терминал койрыгы протеин-протеин үзара бәйләнештә һәм транскрипция факторларын туплауда катнаша дип санала, чөнки C-терминалны бетерү мутацияләре транскрипцияне башлый алмыйлар.Моннан тыш, бу домен берничә сакланган фосфориляция сайтларын үз эченә ала, алар 58 киназ өчен субстратлар.C-терминал доменыннан читтә HMGA1 белән HLA-A һәм H2B үзара бәйләнешне күзәттек, C-терминал домены транскрипция факторын бәйләү өчен кулланыла (5A, C рәсем).HMGA белгечләре гистон H1 белән адаптер ДНКны бәйләү өчен ярышалар, шуның белән мөмкинлекне арттыралар57.Шулай ук, HMGA гистон H2B белән бәйләүче ДНК буенча H1 гистоны белән үзара бәйләнештә булган кебек.HMGB1 дендрит күзәнәкләрендә HLA-A, -B, -C экспрессиясен җибәрә, аларның активлашуына китерә59, ләкин HMG һәм HLA арасында үзара бәйләнеш турында хәбәр ителмәгән.HMGA1 HLA-A α1 һәм α3 доменнары белән, 3 DBD читендәге күпчелек үзара бәйләнешләр белән үзара бәйләнештә булганын ачыкладык (рәсем 5A, C).Безнең кулда HLA-A ядрода локализацияләнгән (мәгълүматлар күрсәтелмәгән), һәм H2B һәм HMGA1 ядрода булуын исәпкә алсак, бу үзара бәйләнеш, мөгаен, ядрода булырга мөмкин.H2B, HLA-A, HMGA1 арасында үлчәнгән махсус кушылмалар 5D рәсемдә күрсәтелгән.
HLA-Aның башка протеиннар белән үзара тәэсире аның α1 һәм α2 доменнарында һәм тәртипсез C-терминал доменында була (6-нчы рәсем).Бу мисалларның берсендә без HLA-Aның LRCH4 бозылган N-терминал койрыгы белән үзара бәйләнештә булуын таптык (6A, D рәсем).LRCH4 TLR4 активлаштыруны һәм LPS цитокин индукциясен көйли, шуның белән тумыштан килгән иммун реакцияне модульләштерә60,61.Бу мембрана протеины, тугыз лейцинга бай кабатлау (LRR) һәм аның эктодомейнында тынычландыручы (CH) гомология мотивы, аннары трансмембрана домены (TMD) 60, 62.CH доменнары протеин-протеинның үзара бәйләнешен арадаш итү турында хәбәр иттеләр 60.LRR һәм CH доменнары арасында якынча 300 аминокислотаның озынлыгы чагыштырмача уңайлы, ләкин тәртипсез.Протеин-протеин челтәрләре һәм 63 весикуляр транспорт арадашчысы буларак тәртип бозылган төбәкләр функциясенә нигезләнеп, без күпчелек протеинның үзара бәйләнеше тәртипсез төбәкләрдә булачагын таптык.MDN1 белән үзара бәйләнеш протеинның озынлыгы буенча таратылды, шул исәптән LRR1, LRR6, CH доменнары, һәм очраклы төбәкләр, H2B нигездә CH доменына бәйләнгән (6A, B).Шунысы игътибарга лаек, үзара бәйләнешнең берсендә дә TMJ кертелмәгән, бу CLMS алымының үзенчәлеген күрсәтә (6A, B).
MDN1 шулай ук ​​HLA-A белок челтәренең бер өлеше итеп билгеләнде (6A рәсем).Ул AAA белгечләр гаиләсенә керә (төрле чаралар белән бәйләнгән ATPases).Бу шул ук N-терминал AAA домены, ул гексамерик боҗрага керә һәм 60S 64 рибосомаль субунитыннан җыю факторын бетерә.dynein64,65,66 белән охшаган.Моннан тыш, Asp / Glu бай төбәгендә MIDAS домены бар (металл ионга бәйле сайт).MDN1 зурлыгы (якынча 5600 аминокислоталар) һәм яхшы өйрәнелгән аксымнар белән чикләнгән гомологиясе аркасында, аның структурасы һәм функциясе кешеләрдә аз билгеле.Без HLA-A, H2B, һәм LRCH4ны MDN1 бәйләүче партнерлар дип билгеләдек һәм PyMol'да протеин комплекслары буларак аларның юнәлешен ачтык (6A, B).Бу өч протеин AAA домены, динейнга охшаган бәйләүче домен, һәм, мөгаен, MIDAS MDN1 домены белән үзара бәйләнештә тора.Алдагы докладта, җим протеиннарын якынлаштыру MDN1 H2B67 гистоны белән бәйле протеин дип билгеләде.Моннан тыш, күптән түгел үткәрелгән тикшеренү шулай ук ​​MDN һәм HLA-B арасында HCT116 күзәнәкләрендә үзара бәйләнешне чистарткан масса спектрометриясен кулланып хәбәр иттеләр, безнең ачышларны хупладылар68.IFNα белән эшкәртелгән үрнәкләрдә бу комплексны ачыклау MDN1 өчен интерферон сигналында роль уйный.
HLA геннары бик полиморфик булганлыктан, без Flo-1 күзәнәкләренең РНК эзләү мәгълүматларыннан HLA-A, -B, -C карталарын укуны эзләдек (мәгълүматлар күрсәтелмәгән).Пептид эзлеклелеге эзлекле уку белән туры килгән HLA-A, -B, -C арасында зур аермаларны күрсәтте, үзара бәйләнгән пептидлар HLA-A урнашкан төбәкләрдә (S3 рәсем).Моннан тыш, без HLA-B / C молекулаларының H2B / HMGA1 / MDN1 / LRCH4 белгечләре белән протеин-протеинның үзара бәйләнешен күзәтмәдек.Бу HLA-A, MDN1, LRCH1 һәм HMGA1 арасында табылган протеинның үзара бәйләнешенең HLA-A специфик булуын күрсәтә.Моннан тыш, үзара бәйләнмәгән үрнәкләргә протеомик анализ күрсәтте (H4-таблица) HLA-A HLA-B яки HLA-C белән чагыштырганда югары эзлеклелектә.HLA-A өчен билгеләнгән пептидлар IFNα белән эшкәртелгән дә, эшкәртелмәгән үрнәкләрдә дә югары интенсивлыкта булганнар.
Монда билгеләнгән үзара бәйләнеш ике протеинның специаль булмаган үзара бәйләнеше аркасында булмавын тәэмин итү өчен, без тагын ике яңа HLA-A үзара тәэсир итүче факторны бергә иммунопрекипитация анализлары белән расладык.Эндоген MDN1 һәм H2B белән HLA-A үзара бәйләнеш IFNα белән эшкәртелгән һәм эшкәртелмәгән Flo-1 күзәнәкләрендә ачыкланган (7 нче рәсем, С4 рәсем).Без HLA-Aның иммунопрекипитларда H2B тарафыннан кулга алынганын һәм бу ассоциация IFNα белән дәвалану аркасында булуын расладык, чөнки HLA-A эшкәртелмәгән күзәнәкләрдән иммунопрекипит үрнәкләрендә булмаган (7A рәсем).Ләкин, безнең мәгълүматлар IFNα H2B һәм MDN1 белән бәйләнешле HLA-A дифференциаль көйләвен күрсәтә.IFNα H2B һәм HLA-A арасында ассоциация тудыра, ләкин MDN1 белән бәйләнешен киметә.MDN1 контрольдә HLA-A белән бәйләнгәнен ачыкладык, һәм IFNα кушылуы IFNα тарафыннан MDN1 индукциясеннән бәйсез бу үзара бәйләнешне киметте (Рәсем 7B, C).Моннан тыш, HLA-A иммунопрепипитация H2Bны A549 күзәнәкләрендә тотты (S4 рәсем), бу үзара бәйләнеш күзәнәк тибыннан бәйсез булуын күрсәтә.Бергә тупланган бу нәтиҗәләр HLA-Aның H2B һәм MDN1 белән интерферон-арадаш үзара бәйләнешен хуплый.
HLA-A H2B һәм MDN1 белән бергә чистарта.Вәкил эндоген H2B (A) һәм MDN1 (B) иммуноблотлары IFNα белән эшкәртелгән Flo-1 күзәнәкләреннән иммунопрекипацияләнде һәм күрсәтелгән антителаларны тикшерделәр.Тычкан һәм куян IgG тискәре контроль буларак кулланылган.(C) Төрле антигеннарның чагыштырма күләме (кертү) күрсәтелгән антителаларга каршы тикшерелгән иммуноблотлар белән сурәтләнә, β-актин йөкләү контроле буларак кулланылды.
H2B-HLA-A-HMGA1 интерферон-индуктив югары ышанычлы челтәрләрнең берсенең структур үзенчәлекләре тикшерелде.Бу комплекста катнашкан аксымнарның конформацион динамикасын аңлау өчен молекуляр динамика модельләштерүен альтернатив алым буларак кулландык (8 нче рәсем).CLMS мәгълүматларыннан алынган мәгълүматлар H2B, HLA-A, HMGA1 аксымнарының төрле конфигурация мөмкинлеген күрсәтә.Шуңа күрә, түбәндәге потенциаль комплекслар эретүче модельдә модельләштерелгән: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, һәм H2B-HLA-A-HMGA1.MOE (Молекуляр Эшләү мохите; Химик исәпләү төркеме Inc., Монреаль, Квебек, Канада) ярдәмендә протеин-протеинның башлангыч экраны бу протеиннар арасында аерылып торган мөмкин конфигурацияләрне тәкъдим итте (8A рәсем).Протеин комплексын визуализацияләү берничә үзара бәйләнешне һәм мөмкин булган конфигурацияләрне ачты (5A, 8).Шулай итеп, мөмкин булган бер конформация 8A рәсемдә күрсәтелгән (кроссовкалар белән язылган) һәм ул MD модельләштерү торбасы ярдәмендә бәяләнде.Моннан тыш, H2B яки HMGA1-ны HLA-A белән бәйләү H2B-ның HLA-A өчен югары якынлыгын күрсәтә (8A рәсем).
H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A, һәм H2B-HLA-A-HMGA1 комплекслары арасында мөмкин булган челтәрләрнең конформацион динамикасы.(А) Сул панель - 2D картасы (SIM-XL программасында ясалган), эчке (кызыл) һәм интермолекуляр (зәңгәр) кроссовкаларның (кросс-ссылка 3,5 итеп куелган).Моннан тыш, ачыкланган үзара бәйләнеш калдыклары H2B, HLA-A, HMGA1 аксымнары структураларында язылган.Бу протеиннарның бәйләнешле конфигурациясе MOE пакетында кертелгән тоташтыру торбасы ярдәмендә алынган.Аскы сул панельдә H2B-HLA-A һәм HMGA1-HLA-A комплексларының төрле протеин-протеин бәйләнеше булган комплекслары күрсәтелә (GBVI / WSA dG; kcal / mol).Б) һәр протеин структурасы өчен атом позицияләренең стандарт тайпылышы (водород атомнарын исәпкә алмаганда).(C) inter 10 нс озынлыкның конкрет үзара бәйләнешен исәпкә алып, төрле симуляцияләнгән комплекслардан интермолекуляр протеин-протеин водород бәйләнеше.H-облигация доноры-кабул итүчесенең кисешү аралыгы 3,5 to, ә донор-H-кабул итүченең кисү почмагы ≥ 160 ° –180 ° итеп куелды.(D) HLA-A-H2B һәм HLA-A-HMGA1 комплексларыннан алынган N 20 нс озынлыктагы HLA-A белок-протеин үзара бәйләнешен формалаштырган калдыклар.Протеин структуралары уртача 100 ns MDS структурасын күрсәтә.(E) HLA-A-H2B һәм HLA-A-HMGA1 комплекслары арасындагы үзара бәйләнеш, H2B-HLA симуляциясе белән күзәтелгән үзара бәйләнеш белән чагыштырганда, ике пептид арасындагы K яки S үзара бәйләнеш мәйданына нигезләнеп 100 нс.Комплекслар / HMGA1-HLA-A / H2B-HLA-A-HMGA1.Crossзара бәйләнешләрне бәяләү өчен бусага бәясе 3.0 итеп билгеләнде, һәм MDS ns 10 ns алып торган үзара бәйләнешләр исәпкә алынды.Протеин структуралары BIOVIA Discovery студиясе (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, АКШ) һәм молекуляр эш мохите (MOE; Chemical Computing Group Inc., Монреаль, Квебек, Канада) пакетлары ярдәмендә визуальләштерелгән.
Вакыт узу белән HLA-A молекулаларының тотрыклылыгы (стандарт тайпылыш; RMSD яки стандарт тайпылыш; RMSF) комплексларда H2B яки HMGA1 аксымнарының HLA-A тотрыклылыгын күрсәтте (8Б рәсем, С5 рәсем).HMGA1 протеины HLA-A B2M мәйданына тыгыз бәйләнгән, HLA-A-HMGA1 яки H2B-HLA-A-HMGA1 комплексындагы HLA-A аминокислоталарның тотрыклылыгына китерә (8Б рәсем, S5 рәсем).Аерым алганда, HLA калдыклары ~ 60-90 һәм ~ 180-210 H2B (FIG. 8B) булганда азрак сыгылучан булулары ачыкланды.H2B һәм HMGA1 H2B-HLA-A-HMGA1 комплексындагы HLA-A белән H2B яки HMGA1 белән бәйләү белән чагыштырганда яхшырак бәйләнеш күрсәттеләр (8C, D; таблица S5).Водород бәйләнешендә катнашкан калдыклар (МД модельле югары эш урыны ns 10 нс) комплекстагы CLMS үзара бәйләнеш мәйданнарына туры килә, бу CLMS белән билгеләнгән үзара бәйләнешнең бик ышанычлы булуын күрсәтә.Ышанычлылык (8E рәсем).CLMS һәм MD модельләштерүдә, HLA-A якынча 190-210 белән 200-220 аминокислоталар арасында H2B һәм HMGA1 бәйләү өчен табылды (FIG. 8E).
Протеин-протеинның үзара бәйләнеше динамик структур челтәрләр формалаштыра, алар кайбер стимулларга җавап итеп күзәнәкләр арасындагы аралашуны арадаш итәләр.Күпчелек протеомика алымнары протеинның тотрыклы дәрәҗәсендәге үзгәрешләрне ачыклый, протеин-протеинның үзара тәэсир итү динамикасы бәйләүче интерфейсларны алу өчен өстәмә кораллар таләп итә, һәм CLMS шундый коралларның берсе.Интерферон сигнализация системасы - цитокин челтәре, ул күзәнәкләргә экологик патоген һәм эчке патологик сигналларга җавап бирергә мөмкинлек бирә, интерферон-индуктив булмаган аксымнар индуктивлыгы белән тәмамлана.Интерферон-протеиннар панели арасында яңа протеин-протеинның үзара бәйләнешен ачыклау мөмкинлеген ачыклау өчен без CLMS кулландык.Протеин комплексларын алу өчен интерферон-җаваплы Flo-1 күзәнәк моделендә глобаль протеинны үзара бәйләү анализы кулланылды.Триптик пептидларны үзара бәйләнмәгән һәм үзара бәйләнгән күзәнәкләрдән чыгару пептидларны санарга, юлны баетырга һәм билгеләнгән LFQ интенсивлыгы белән пептид озынлыгын таратырга мөмкинлек бирә.Каноник интерферон-индуктив булмаган протеиннар уңай эчке контроль итеп билгеләнде, шул ук вакытта MX1, UP18, OAS3 һәм STAT1 кебек каноник интерферон-индуктив протеиннарның яңа интермолекуляр һәм күзәнәкара бәйләнешле кушылмалары күзәтелде.Төрле структур үзенчәлекләр һәм функциональ өлкәләрдәге үзара бәйләнешләр тикшерелде.
HLA-A, MDN1 һәм H2B арасындагы үзара тәэсир итү IFNα белән эшкәртелгән һәм эшкәртелмәгән Flo-1 һәм A549 күзәнәкләрендә иммуноблоттинг ярдәмендә ачыкланган.Безнең нәтиҗәләр HLA-A комплексларының H2B белән IFNα бәйләнешле булуын күрсәтәләр.Эшебез бу ике комплексның локализациясен алга таба өйрәнү өчен кызыклы юл.Шулай ук ​​күзәнәк тибындагы бәйсез интерферон-арадаш протеинның үзара бәйләнешен ачыклау өчен, CLMS алымын күзәнәк сызыклары панеленә киңәйтү кызык булыр.Ниһаять, без H2BFS-HLA-A-HMGA1 комплексында катнашучы аксымнарның конформацион динамикасын аңлау өчен альтернатив алым буларак MD модельләштерүен кулландык, алар молекуляр һәм интермолекуляр кросс сөйләшүләрен күзәттеләр.CLMS мәгълүматларыннан алынган мәгълүматлар H2BFS, HLA-A, HMGA1 протеиннарының төрле конфигурация мөмкинлеген күрсәтә.Бу протеин комплекслары арасында мөмкин булган төрле конфигурацияләр CLMS мәгълүматлар базасында күзәтелгән охшаш берничә үзара бәйләнешне ачты.Безнең ысулның төп көчләренең берсе - ул HLA кебек югары полиморфик геннарның үзара бәйләнешен җиңел ачыкларга мөмкинлек бирә, шуңа күрә өйрәнү авыр булган HLA гаплотип специфик белгечләренең үзара бәйләнешен өйрәнү кызык булыр.Бергә тупланган мәгълүматлар күрсәтә, CLMS интерферон-сигнал челтәрләрен аңлавыбызны киңәйтү өчен һәм шеш микроэнергиясендә катлаулырак күзәнәкләр системаларын өйрәнү өчен нигез бирә ала.
Flo-1 күзәнәкләре ATCC-тан алынган һәм DMEM (Gibco) белән сакланган, 1% пенициллин / стрептомицин (инвитород), 10% фетал бовины серумы (Gibco) белән тулыландырылган һәм 37 ° C һәм 5% CO2 сакланган.Инкубация.Күзәнәкләр IFNα14 белән эшкәртелгәнче 70-80% кушылуга кадәр үскәннәр (Эдинбург протеин җитештерү корылмасы җитештергән).Бүтән химикатлар һәм реагентлар Сигма Алдричтан сатып алынган, башкача әйтелмәгән булса.
Flo-1 күзәнәкләре 6 кое тәлинкәләрдә эшкәртелде һәм икенче көнне күзәнәкләр 10 ng / ml IFNα14 белән 24 сәгать дәвамында эшкәртелде, якынча 80% кушылу.Күзәнәкләр ПБС белән өч тапкыр юылды һәм яңа әзерләнгән DSS (Термо Фишер Фәнни) (ДМСОда эретелгән) белән 5 минутта 37 ° C температурада 5 минутка соңгы концентрациягә кадәр 0,5 мм.DSS үзара бәйләнеш реакциясе ПБС белән алыштырылды һәм калдык DSS сүндерелде, 20 мм Трис (pH 8.0) ПБСка 15 минутта 37 ° C ка.Күзәнәкләр кырылып, аз бәйләүче торбаларда җыелганнар (Кислород).
Күзәнәк пелеты 300 µл карбамид лизис буферы белән (8 М карбамид, 0,1 М Трис, pH 8.5) 30 минут эчендә бүлмә температурасында вакыт-вакыт калтыранып лизланган.Барлык центрифугация адымнары 14,000 xg 8 ° C температурада башкарылды.Лизатны 10 минутка центрифуга һәм супернатантны яңа трубага күчерегез.Калган ачык кисәкчәләр икенче лизис буферының 150 μлында (2 М карбамид, 2% (w / v) SDS (натрий додекил сульфаты)) бер тигез су эремәсе алынганчы 30 минут яки аннан да күбрәк вакыт эчендә эретелде.Лизат 20 минутка центрификацияләнде һәм супернатант алдагы адымда алынган лизат белән кушылды.Протеин концентрацияләре Micro BCA анализы (Термо Фишер Фәнни) ярдәмендә микроплат процедуралары җитештерүче күрсәтмәсе буенча бәяләнде.Samрнәкләр тиз сыек азотта туңдырылган һәм -80 ° C сакланган.
Якынча 100 μг эри торган үзара бәйләнгән протеин Висневски һ.б. тасвирлаганча үзгәртелгән фильтрлау үрнәге әзерләү протоколы (FASP) ярдәмендә эшкәртелде.69 Кыскасы, протеин 200 µл карбамид буферы белән бәйләнгән (0,1 М Трисда 8 М карбамид, pH 8.5), вортекс һәм ярты.Барлык центрифугация адымнары 14,000 xg 25 ° C температурада башкарылды.Бер-берсенә бәйләнгән протеин лизатының беренче яртысы 10 kDa Микрокон центрифугаль фильтр җайланмасына Ultracel-10 мембранасы (Мерк) белән җиһазландырылган, аннары фильтрда 25 минут центрифугация.Аннары протеинның икенче яртысын фильтрга кушыгыз һәм шул ук адымнарны кабатлагыз.Протеиннарны торгызу 100 мм l 17 мм трис (2-карбоксиетил) фосфин гидрохлоридын (TCEP) карбамид буферына кушып башкарылды.Термомиксерда торгызу 600 минутта 37 минутта 30 минутта торгызылды.Моннан тыш, багана центрифугацияләнде һәм кыскартылган үзара бәйләнгән протеин карбамид буферында 100 мм 50 мм йодоцетамид кулланып алкилатланды.Алкиляция реакциясе бүлмә температурасында 20 минут караңгыда үткәрелде.Колоннаны әйләндерегез, багана диварларын 100 µл карбамид буферы белән 3 тапкыр юыгыз, аннары центрифуга.Шул ук операция 100 мм аммиак биарбонатыннан 100 μл кулланып 3 тапкыр башкарылды.Трипсинизация алдыннан коллекция трубасын яңасына алыштырыгыз.50 мм аммиак биарбонаты һәм трипсин буферында (Промега) эретелгән 1 µл трипсин булган ашкайнату буферын өстәгез.Трипсинның протеинга мөнәсәбәте 1:33 тирәсендә сакланган, һәм ашкайнату реакцияләре төнлә 37 ° C дымлы камерада инкубацияләнгән.Crossзара бәйләнгән пептид фильтрдан центрифугация белән 25 минутка чыгарылды.Пептидны торгызу фильтрга 50 μл 0,5 M NaCl кушып яхшыртылды, аннары 25 минут центрифугация.
C18 Micro Spin баганалары (Гарвард аппараты) үзара бәйләнгән триптик пептидларны азайту өчен Bouchal et.70 тасвирлаган протоколдан соң тозсызландыру өчен кулланылды.Кыскасы, C18 спин баганалары ацетонитрилда (AcN) (Мерк) 0,1% формаль кислотаны (ФА) өч юу һәм 0,1% ФА ике юу белән активлаштырылды.Колонка 15 минут эчендә 0,1% ФА белән гидратланган.Samрнәкләрне спин баганаларына йөкләгез һәм 0,1% FA белән 3 тапкыр юыгыз.Сусызландырылган пептидлар эзлекле рәвештә градиент белән 50%, 80% һәм 100% AcN кулланып 0,1% ФАда ясалдылар.Samрнәкләр SpeedVac Plus концентраторында (Эппендорф) калдык сыеклык бөтенләй юкка чыкканчы киптерелгән.Сайланган пептидлар 100 μлда 0,08% трифлороацетик кислотасында 2,5% AcNда эретелде һәм концентрацияләр NanoDrop 2000 (Термо Фәнни) белән үлчәнде.LC-MS / MS системасына бер үрнәккә якынча 1 μг үзара бәйләнгән пептид салынган.
Crossзара бәйләнгән пептидлар UltiMate 3000 RSLCnano LC системасында (Термо Фәнни) Orbitrap Exploris 480 масса спектрометрына тоташтырылган (Термо Фәнни).Crossзара бәйләнгән пептидлар 300 µm ID, 5 мм озынлыктагы C18 колоннасына кадәр C18 PepMap100 сорбенты һәм 5 µm PepMap сорбенты белән тутырылган (Термо Фәнни).Насос агымын 5 µл / мин 0,08% трифлороацетик кислотасы белән йөкләгез, 2,5% AcNда эретелгән.Crossзара бәйләнгән пептидлар аналитик кушылган кремний баганасында аерылды, эчке диаметры 75 мм һәм озынлыгы 150 мм, 2 μm PepMap сорбенты белән тутырылган (Термо Фәнни).А һәм В мобиль этаплары суда 0,1% ФА һәм ацетонитрилда 0,1% ФАдан тордылар.Градиент 2,5% Втан башлана һәм 90 минут эчендә 40% B га кадәр, аннары киләсе 2 минутта 90% B га кадәр арта.Кәрәзле фаза составы 10% 90% B дәрәҗәсендә сакланган, аннары 2 минут эчендә турыдан-туры 2,5% B ка кадәр кимегән.Колонка киләсе цикл алдыннан 8 минут эчендә 2,5% В тигезләнде.Аналитик баганадан алынган үзара бәйләнгән пептидлар наноэлектроспрай ионлаштыру (NSI) чыганагында ионлаштырылды һәм Эксплорис 480 масса спектрометрына (Термо Фәнни) кертелде.
Orbitrap Exploris 480 масса спектрометр уңай мәгълүмат корреляция режимында эшләде.Тулы сканер секция режимында 120,000 резолюциядә, м / з 350 Т дан м / з 2000 Т диапазонына кадәр башкарылды.Нормалаштырылган AGC максаты максималь кертү вакыты 50м булган 300% итеп билгеләнде.Пептидлар өчен моноисотопның иң югары ноктасын ачыклау булдырылган.Чикләү ял итү параметры бик аз прекурсорлар табылса дөрес була.Прекурсорның минималь ион көче 5.0e3 итеп билгеләнде һәм экспериментларга прекурсор корылмасы +8 кадәр кертелде.
Мәгълүмат корреляция режимындагы төп сканерлар арасында цикл вакыты 2,5 секундка билгеләнде.Динамик масса чыгару прекурсор ионының беренче фрагментыннан соң 20 с.Прекурсор изоляциясе тәрәзәсе 2 Th итеп куелган.Нормальләштерелгән бәрелеш энергиясенең тотрыклы бәрелеш энергиясе режимы белән мәгълүмат MS / MS сканерында сайланган.Бәрелеш энергиясе 30% тәшкил итә.Орбитрап резолюциясе 15000, AGC максаты 100% итеп билгеләнде.Гадәттәге максималь инъекция вакыты 60 миллисекундка билгеләнгән.
Протеин-протеин челтәрен үзара бәйләнгән үрнәкләрдә күзәткәнче, без чимал файлларны MaxQuant пакеты (1.6.12.0 версиясе) ярдәмендә 26,27 эшкәрттек, үрнәкләрдә эзләнгән пептидлар / аксымнарны ачыклау өчен.Моннан тыш, охшаш протеомик анализлар бәйләнмәгән Flo-1 үрнәкләрендә IFNα белән эшкәртелгән һәм эшкәртелмәгән.MS / MS мәгълүматлары UniProt кеше базасында (www.uniprot.org) эзләнде (2020 елның 12 августында йөкләнде, 75 093 язма бар) Андромеда27 эзләү системасы ярдәмендә.Эзләү ферментның үзенчәлеген һәм дезамидациянең (N, Q) һәм оксидлашуның (M) төрле модификацияләрен күрсәтмичә үткәрелде.Прекурсор масса толерантлыгы 20 минутта һәм продукт ионнары 0,02 Да.Башлангыч һәм максималь тайпылыш 10 минутка куелды.Пептидның максималь массасы 4600 Да һәм эзлеклелеге 7-25 аминокислоталар арасында (aa) куелды.Алга таба статистик анализ Персеус программасы ярдәмендә башкарылды (1.6.10.45 версия).Протеинның эчтәлеге протеинның спектраль интенсивлыгын нормалаштырып исәпләнде (LFQ интенсивлыгы; билгесез санлаштыру) 27 һәм интенсивлык кыйммәтләре Log2гә үзгәртелде.Аларның пептид интенсивлыгы белән билгеләнгән аксымнарның иерархик кластеры R (v 4.1.2) pheatmap (v1.0.12) пакеты ярдәмендә төзелгән.Pathway баету анализы IFNα белән эшкәртелгән протеиннар өчен Reactome юл базасы ярдәмендә башкарылды, алар эшкәртелмәгән үрнәкләр белән чагыштырганда дүрт тапкыр активлаштылар.
LC-MS / MS күзәткән протеин комплексларының лизин (К) яки серин (S) специфик химик үзара бәйләнешен ачыклау, үзара бәйләнгән пептидлар (SIM-XL) 29 спектроскопик идентификация машинасы ярдәмендә башкарылды.Беренчедән, интерферон белән бәйләнгән (IFN) ДНК зарарлы каршылык имзасы (IRDS) геннары арасында мөмкин булган үзара бәйләнеш Падария һ.б. тасвирланган IRDS белок мәгълүматлар базасы ярдәмендә тикшерелде.UniProt-ның барлык шартларын һәм кабатлауларын тикшерү исәпләү интенсив, шуңа күрә бөтен UniProt мәгълүмат базасы (www.uniprot.org) (2020-нче елның 12-нче августында йөкләнгән, 75,093 язма бар) IFNα белән эшләнгән кабатлауларга каршы.Trustгары ышаныч үзара бәйләнеш өчен фильтрларның берсе.Алынган бу югары әһәмиятле үзара бәйләнешләр киңәйтелде һәм барлык кабатлауларда һәм шартларда сынадылар.
SIM-XLда DSS кросс-линкер өчен кулланылды һәм XL авырлык сменасы һәм модификация авырлыгы сменасы тиешенчә 138.06 һәм 156.07 итеп куелды.Түбәндәге үзара бәйләнешле реакция сайтлары карала: КК, КС һәм КН-ТЕРМ, хәбәрче ионсыз.Прекурсор да, фрагмент ppm да 20гә, Xrea бусагасы 0,15 итеп билгеләнде.Трипсин тулысынча конкрет дип саналды, һәм югары энергияле C-трап (HCD) фрагментлаштыру ысулы кертелде.XCorr динамик DB кыскарту бусагасы һәм динамик DB киметү өчен минималь пептидлар саны тиешенчә 2,5 һәм 2 итеп билгеләнде.Башка параметрлар: моноизотоп ихтималлыгы һәм очраклы очракларның өзелүе, минимум 4 AA калдыклары һәм максималь чыбык корылмасы, һәм 3 максимум сагынылган бүленешләр.Нәтиҗә ясалган 2D карталары (SIM-XL) анализланды һәм 2D карталарын төзү өчен xQuest28 график тасвирламасы кулланылды.Протеин структураларындагы протеин кроссовкалары PyMolда бирелгән (PyMOL молекуляр графика системасы, 2.0 версиясе Шрөдингер, ООО).
Протеин модель структуралары Phyre2 серверы ярдәмендә ясалган (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 гомологияне модельләштерү һәм "Яшерен Марков методы" принципларын кулланып.Phyre2 билгеле протеин структуралары белән эзлеклелектә тигезләнү нигезендә модель структуралар чыгара.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, һәм MDN1 протеиннары өчен 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, 6i2665 шаблон структуралары кулланылды.Моннан тыш, AlphaFold71 MX1, UBP18 һәм ROBO1 структурасы да каралды.Белгеч структурасы BIOVIA Discovery Studio Visualizer пакеты (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, АКШ) һәм Молекуляр Операция Мохит Пакеты (MOE; Chemical Computing Group Inc., Монреаль, Квебек, Канада) ярдәмендә визуальләштерелгән.