310.

Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт.Сез чикләнгән CSS ярдәме белән браузер версиясен кулланасыз.Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та туры килү режимын сүндерегез).Моннан тыш, дәвамлы ярдәмне тәэмин итү өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәбез.
Слайдка өч мәкалә күрсәтүче слайдерлар.Слайдлар аша хәрәкәт итү өчен арткы һәм киләсе төймәләрне кулланыгыз, яки һәр слайд аша хәрәкәт итү өчен ахырдагы слайд контроллер төймәләрен кулланыгыз.

Спецификация

310 10 * 1 мм Дат басмас корычтан торбалар белән тәэмин итүчеләр

Химик состав

Механик үзлекләр

Рекомбинант үрмәкүч ефәк аксымнары (үрмәкүч ефәк аксымнар) яңа биоматериаллар үсешендә бик күп потенциаль кулланмаларга ия, ләкин аларның мультимодаль һәм агрегат характерлы табигате аларны алу кыен һәм куллану җиңел итә.Монда без рекомбинант миниатюр спидроин протеиннары һәм, иң мөһиме, N-терминал домены (НТ) үзе тиз арада 37 ° C температурада үз-үзен тәэмин итүче һәм үтә күренмәле гидрогелларны барлыкка китерә.НТ һәм яшел флуоресцент протеиннан яки пурин нуклеозид фосфорилазадан торган кушылу протеиннары тулы функциональ кушылу протеиннарын формалаштыралар.Гидрогеллар.Безнең нәтиҗәләр шуны күрсәтә: рекомбинант НТ һәм кушылу протеиннары югары күрсәткеч бирә һәм гидрогелларны ачыклык, үзара бәйләнешсез геляция һәм югары тыгызлыктагы актив аксымнарны турыдан-туры иммобилизацияләү кебек җәлеп итүчән сыйфатлар белән тәэмин итә.
Spрмәкүчләрнең җиде төрле ефәк бизләре бар, аларның һәрберсе билгеле бер ефәк җитештерә.Барлык җиде ефәк төр дә үрмәкүч ефәк аксымнардан (спидроиннар) якынча 6000 калдыклардан тора һәм N-һәм C-терминал доменнары (NT һәм CT) белән уратып алынган зур үзәк кабатлау өлкәсен үз эченә ала.Иң киң өйрәнелгән ефәк төре, төп ампулла, төп ампулла бизе җитештерә.Бу биздә эпителий күзәнәкләренең монолайеры спидроин белокларын синтезлый һәм без люменына җибәрә, алар бик югары концентрацияләрдә (30-50% w / v) 3,4 эри торган формада (допинг) бар.Бездәге төп ампуллар спидроин белокларын оештыру һәм конфигурацияләү турында бәхәсләштеләр, ләкин күпчелек эксперименталь дәлилләр гомумән гелик һәм / яки очраклы гелик конформация һәм микель яки лампель структуралары булуын күрсәтәләр5,6,7,8,9,10.Кабатланучы доменнар ефәк җепселләрнең механик үзлекләрен көйлиләр, β-нанокристаллар һәм аморф структуралар ясыйлар, 11,12,13,14,15, соңгы доменнар ефәк бизәкләре үзгәрү шартларына җавап итеп ефәк җепселләрне көйлиләр16,17,18.Ефәк формалашуны контрольдә тотып, 19. Терминал доменнары эволюцион рәвештә саклана һәм аларның функциясе барлык спидроин белгечләре өчен уртак булырга мөмкин 2,20,21.Без аша үткәндә, спидроинның рН якынча 7,6 дан <5.716га кадәр кими һәм әкренләп тарала торган канал аша хәрәкәт ярдәмендә арадашлашу һәм сузылу белән арта.Чишелештә, CT α-гелик конституцион параллель димер17, ләкин түбән рН һәм кыргыч көчләргә җавап итеп, КТ 16-17 катламнарын ачып җибәрә, 16-нчы Конвертның кабатланган өлкәләрендә β-катламнарны этәрергә мөмкин. НТ мономерик астында Без люменындагы шартларны чагылдырган һәм спидроинның эрүчәнлеген арадашлаучы шартлар, ләкин рН кимегәндә, карбоксил кислотасы ян чылбырларының протонациясе якынча 6,5 pKa белән NT димеризациясенә китерә, шуның белән НТны тотрыклыландыра һәм спидроинны зурлый. күләмнәр.челтәрләр 16,18.Шулай итеп, НТ филамент формалашуда төп роль уйный, каплаудагы мономердан җепселдәге димерга үзгәрә23,24,25.НТ 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 бүгенге көнгә кадәр өйрәнелгән барлык шартларда бик эри торган һәм гелик булып кала, бу гетерологик протеиннар җитештерү өчен эретүчәнлекне арттыручы ярлык булып үсешенә этәргеч биргән.
Чистарту өчен рекомбинант мини үрмәкүч ефәк протеины, бер НТ, бер кыска кабатлау өлкәсе, бер КТ һәм His6 теге (His-NT2RepCT), буферда туган үрмәкүч ефәк протеины кебек эри һәм ефәк үрмәкүчнең төп мөһим үзенчәлекләрен охшата. .25.31.Аның-NT2RepCT биомиметик машина ярдәмендә өзлексез җепселләргә әйләнергә мөмкин, анда pH 8 эри торган каплау pH 525,32,33,34,35 су мунчасына чыгарыла.Э.-Колиның биореактор ферментациясе His-NT2RepCT һәм аннан соңгы дәвалау нәтиҗәсендә чистартылганнан соң> 14 г / Л уңыш китерде.Hisгары уңыш, югары эрүчәнлек, һәм His-NT2RepCTның кислота шартларына адекват реакциясе барысы да NT23, 25, 34 белән бәйле.
Монда без рекомбинант спидроин протеиннарыннан ачык гидрогелларның тиз формалашуы турында хәбәр итәбез, шул исәптән НТ гына, 37 ° C протеин эремәсен инкубацияләп.Тиофлавин Т флюоресенция (ThT), Фурье инфра-кызыл спектроскопия (FTIR), атом магнит резонансы спектроскопиясе (NMR) һәм электрон микроскопия (TEM) кулланып, НТ һәм микроспидер белгечләренең структур үзгәрүләр β-таблицаларга һәм амилоид сыман фибрилларга әверелүен ачыкладык. гельләр барлыкка килгәндә.Моннан тыш, НТ һәм яшел флуоресцент белок (GFP) яки пурин нуклеозид фосфорилаза (PNP) кушылу протеиннары тулы функциональ кушылу фрагментлары белән гидрогеллар ясыйлар.Гетерологик хуҗаларда югары үткәрүчәнлек, физиологик шартларда гидрогелларның тиз формалашуы, инженерлык функцияләре белән гидрогелларны нәтиҗәле җитештерү мөмкинлеген ача.
Күпчелек хәбәр ителгән рекомбинант спидроин белгечләреннән аермалы буларак, His-NT2RepCT Tris-HCl буферында pH 8дә тотрыклы һәм явым-төшемсез 500 мг / млга кадәр тупланырга мөмкин25.Шуңа күрә, без бу протеинның 37 ° C температурада инкубацияләнгәндә оптик яктан ачык, үз-үзен тәэмин итүче гидрогелларны тиз формалаштыруына гаҗәпләндек (1б-д рәсем).Алга таба тикшеренүләр күрсәткәнчә, His-NT2RepCT гелациясе протеин концентрацияләренең киң спектрында булган (10-300 мг / мл) һәм бу концентрация геляция вакыты белән капма-каршы бәйләнештә булган (1с рәсем һәм өстәмә рәсем 1).Аның-NT2RepCT арадаш гидрогел формалашуының нинди өлешләрен ачыклау өчен, без һәр доменны индивидуаль һәм төрле комбинацияләрдә фласс инверсия анализы ярдәмендә тикшердек (1а рәсем, б).Рекомбинант спидроинның барлык сынап каралган фракцияләре 1 сәгатьтән дә азрак вакыт эчендә формалашкан гельләр (300 мг / мл протеин концентрациясендә), 2Rep (1б рәсем).Бу NT һәм CT берүзе, яки кабатлау белән бәйләнгән, 37 ° C температурада гел була алуын һәм His6 тэгының бу процесска бернинди дәрәҗәдә тәэсир итмәвен күрсәтә.НТ - бик эри торган һәм тотрыклы протеин, һәм рекомбинант спидроин гидрогелларының элеккеге докладлары геляция эффектларын кабатланган төбәкләрдә һәм / яки КТларда конформацион үзгәрешләр белән бәйлиләр, NT үзе булдыра ала.Геляция ачылышы көтелмәгән иде.Өстәмә таблица 1) 37, 38, 39. Искиткеч, НТ 10 минут эчендә ≥ 300 мг / мл концентрациясендә (1с рәсем).НТның төрле концентрацияләре булган шешә инверсия экспериментлары күрсәткәнчә,> 50 мг / млда NT эремәсе тиешле концентрациядә His-NT2RepCT белән чагыштырганда тизрәк эрелгән (w / v, Рәсем 1c).
Бу әсәрдә өйрәнелгән төрле спидроин конструкцияләренең схематик чагылышы.b Гел вакыты 37 ° C төрле рекомбинант спидроин белгечләре өчен (300 мг / мл) касәне кире борып тикшерелгән.КТ гел шунда ук инкубациясез (<300 мг / мл), 2Rep явым-төшем (300 мг / мл, 5 мм шкала).c His-NT2RepCT һәм NT гел вакыты 37 ° C.d Hisрмәкүч белән His-NT2RepCT һәм NT гидрогелларының фотолары һәм астына бастырылган "НТ" хәрефе (икесе дә 200 мг / мл, масштаблы 5 мм).
Төрле рекомбинант спидроин белоклары белән барлыкка килгән гидрогеллар бераз төрле төсләргә ия, һәм күзне ялан күзәтү төрле дәрәҗәдәге ачыклыкны күрсәтә (1б рәсем).НТ гельләре аеруча ачык, ә башка гельләр ачык түгел.Аның-NT2RepCT һәм цилиндрик трубаларга салынган НТ гельләре формадан чыгарылырга мөмкин (1-нче рәсем).
Табигый үрмәкүч ефәк каплагыч гел хәзерге вакытта рекомбинант спидроин протеиннарының геляциясенә китергәнен ачыклау өчен, Швеция күпере үрмәкүченең зур ампулла безеннән (Лариниоид склопетариус) капламалар җыелган.Катламнар 20 мм Tris-HCl буферында 50 мг / млда сакланганнар (үлчәнгән коры авырлыкка нигезләнеп), ләкин 21 көнлек инкубация вакытында 37 ° C температурада бернинди геляция күзәтелмәде (өстәмә рәсем 2а).
Бу гельләрне бәяләү өчен, реологик үлчәүләр геляция процессын өйрәнү һәм гомуми механик үзлекләрне билгеләү өчен кулланылырга мөмкин.Аерым алганда, югары температурада саклау модулусын (эластиклыгы) мониторинглау гелл температурасы, шулай ук ​​каплауның вискоэластик үзлекләре турында мәгълүмат бирә ала.Температураның күтәрелү тәҗрибәләре (табигый ефәк запас эремәләрен кулланып үткән тикшеренүләргә нигезләнеп, 25-45 ° C температурада 1 ° C / мин кулланып) 40,41 күрсәткәнчә, His-NT2RepCT һәм NT эремәләренең саклау модуле температураның артуы белән арткан.арттырылды (2 нче рәсем һәм өстәмә рәсем 3).Искәртеп узабыз, NT модуле His-NT2RepCT белән чагыштырганда түбән температурада үсә башлады, НТ турыдан-туры His-NT2RepCT белән 37 ° C инкубацияләнгәндә күзәтелгән тизрәк гель вакытына туры килә (1 нче рәсем).Соңрак температура төшкәннән соң, саклау модулусы түбән кыйммәтләргә кире кайтмады һәм югалту модулусында калды (өстәмә рәсемне кара 3), бу термик кире кайтарылмый торган тотрыклы геляцияне күрсәтә.Геляциядән соң, соңгы эластик модуль 100-500 мг / мл концентрациясендә His-NT2RepCT гидрогеллары өчен 15-330 kPa арасында, һәм NT гидрогеллары өчен соңгы эластик модуль (100-500 мг / мл) 2 дән 1400гә кадәр. kPa (рәсем, 2 һәм тулы пандус мәгълүматлары) өстәмә рәсемне карагыз).
His-NT2RepCT (300 мг / мл) һәм b NT (300 мг / мл) үлчәү вакытында температураның үзгәрүе.Уклар температура тенденциясен күрсәтәләр, һәм саклагыч модуль мәгълүматларының җиңелрәк күләгәсе инструмент өчен түбән момент бәяләрендә сынауны сурәтли, бу тавышның артуы.c His-NT2RepCT һәм NT-ның соңгы модуль туплануы күтәрелгән температурадан соң (100, 300, һәм 500 мг / мл).Барлык модуль укулары 0,1 Гц ешлыгында алына.
Геляция белән бәйле конформацион үзгәрешләрне тикшерүнең потенциаль ысулы буларак, без аның-NT2RepCT һәм NT FTIR спектрын 37 ° C градуска кадәр һәм аннан соң яздырдык (3а рәсем, б).Көтелгәнчә, His-NT2RepCT һәм NT эремәләре спектры α-геликс / очраклы кәтүк икенчел структурасын күрсәтүче протеиннарга туры килә, 1645 см-1 дәрәҗәсендә.Ике гидрогел өчен дә геляция I уртасында ике кулның барлыкка килүенә китерде, якынча 1617 см-1 һәм 1695 см-1 (рәсем 3а, б), антипаралл параллель структуралар барлыкка килүен күрсәтә.Бу үзгәрешләр шулай ук ​​тиешле икенче тудыру һәм аерма геляция спектрында ачык күренә (өстәмә рәсем 4б).NT β катламының ике полосасы His-NT2RepCTныкына караганда күбрәк күренә, бу NT гидрогелындагы β катлам полосаларының гомуми эчтәлеге NT2RepCT гидрогелына караганда югарырак булуын күрсәтә.
His-NT2RepCT һәм b NT (500 мг / мл) FTIR үзләштерү спектры (эремә) алдыннан һәм (гель) инкубациядән соң 37 ° C.c 50 мг / мл NT2RepCT гель һәм d NT рәсемнәре.Масштаб бар 200 нм.e His-NT2RepCT һәм NT гидрогелларының җепсел диаметрлары.n = 100 үлчәнгән фибрил, б <0.0001.Хата юллары стандарт тайпылышны күрсәтә.Хата барларының үзәге - уртача.Статистик анализ өчен яраксыз т-тест (ике койрыклы) кулланылды.f Төрле рекомбинант спидроин белгечләренең ThT флюоресенциясе (100 мг / мл) 37 ° C калтырамыйча.g NT (100 мг / мл) прививка экспериментлары 100 мг / мл НТ геленнән 0%, 5%, 10%, һәм 20% орлык белән.
Электрон микроскопия (TEM) ярдәмендә гель анализы күрсәткәнчә, гидрогель амилоид сыман фибриллардан тора (3с, 3д рәсемнәр).Н.Бу нәтиҗәләр безгә тиофлавин T (ThT) анализы ярдәмендә фиброз кинетикасын күзәтергә мөмкинлек бирде.Барлык рекомбинант спидроин протеиннары өчен, флуоресцент сигнал үрнәкләр 37 ° C инкубацияләнгәндә артты (3ф рәсем, өстәмә рәсем 5а).Бу табышмакка туры китереп, NT һәм His-NT2RepCT микроскопик экспертиза геллинг шартларында ThT флюоресенциясенең бердәм артуын ачыклады, ThT-позитив агрегатларның җирле туплануы булмаса (өстәмә рәсем 5б, с).ThT-позитив фибрилларның формалашуы NT һәм His-NTCT турбитлылыгының артуы белән бергә булмады (өстәмә рәсем 5d), димәк, гельдәге фибриллар челтәре гел ачыклыгын бозмыйча барлыкка килергә мөмкин.Алдан формалашкан фибрилларны аз күләмдә өстәп орлык кайбер амилоидларның фибрил формалашуын сизелерлек тизләтә ала, ләкин НТ гидрокоагулантлары эремәсенә 5%, 10% яки 20% (w / w) NT кушып.орлык эффекты (рәсем 3г).Бәлки, бу гидрогелдагы фибрилларның чагыштырмача тотрыклы булуы һәм орлык буларак кулланылмавы белән бәйледер.
Рекомбинант спидроин белгечләренең югары температурада көтелмәгән тәртибе алга таба атом магнит резонансы (NMR) спектроскопия тикшеренүләрен гел формалашуы белән бәйле конформацион үзгәрешләрне ачыкларга этәрде.His-NT2RepCT эремәләренең NMR спектры 37 ° C вакыт эчендә язылган, CT әле өлешчә катланган, ә NT һәм 2Rep сигналлары юкка чыккан (4а рәсем), бу нигездә NT һәм 2Rep аның формалашуын өлешчә контрольдә тота. NT2RepCT гидрогель.КТ сигналы шулай ук ​​үзенең оригиналь интенсивлыгының 20% тәшкил итте, КТ шулай ук ​​гидрогел структурасына кертелгәнен күрсәтә.КТның кечерәк өлеше өчен, ул принкубацияләнгән үрнәктәге кебек мобиль һәм шулай итеп NMR чишелеше белән күзәтелә, спектрда беренче 10 структуралы калдык өчен сигналлар юк, мөгаен, His-NT2Repның бәйләнгән өлешен авыр имобилизацияләү аркасында.Гидрогеллар -NT2RepCT дәүләтнең NMR спектры α-шакмаклар һәм β-катламнарның һәм аз күләмдә очраклы кәтүк конформациясенең булуын ачыклады (4б рәсем).НТда гына булган метионин калдыкларын химик смена анализы күрсәтте, бу домен β-таблица структурасына әверелгән.Чишелештә НТ вакытына бәйле спектр сигнал интенсивлыгының бертөрле кимүен күрсәтте (4с рәсем), һәм НТ гидрогелларының каты торышлы NMR НТ калдыкларының күбесенең таблицаларга әйләнүен күрсәттеләр (4d рәсем).2Rep конформациясе агрегат тенденциясенә карап аерым билгеләнә алмады.Ләкин, NTCT һәм His-NT2RepCT гидрогелларының каты торышы NMR спектры бик охшаш иде (4б рәсем; өстәмә рәсем 6б), бу 2Rep His-NT2RepCT гидрогелының структур өлешенә аз өлеш керткәнен күрсәтә.КТ гидрогеллары өчен α-шакмаклар, β-таблицалар, очраклы гелик икенчел структуралар барлыгы ачыкланды (өстәмә рәсем 6d).Бу КТның кайбер өлешләренең α-шакмак булып калуын, калганнары β-таблицага әверелүен күрсәтә.Шулай итеп, NMR спектроскопия нәтиҗәләре НТның гидрогел формалашуы өчен мөһим булуын күрсәтә, шулай ук ​​2Rep һәм CT белән кушылгач, таблицаның конформациясенә әверелә.Моның белән эзлекле рәвештә, без күптән түгел амилоид киңлек фермерларының НТ доменының барлык биш шакмакларында барлыкка килүен ачыкладык, һәм Вальс алгоритмы геликс 1дә амилоидоген өлкәсен фаразлады (4e рәсем).
15N-HSQC 2D спектры 10 мг / мл His-NT2RepCT эремәсе (зәңгәр) һәм инкубациядән соң 19 сәгатьтән соң (кызыл) 37 ° C.Кызыл спектрдагы индивидуаль кросс һәм F24, G136, polyA зәңгәр спектрдагы аминокислота символлары һәм калдык саннары белән күрсәтелә.Инцетлар сигнал интенсивлыгының NT, 2Rep, CT доменнарыннан сайланган калдыклар өчен вакытында бәйләнешен күрсәтәләр.b Аның-NT2RepCT гидрогелларының каты дәүләт радиоэффектлары (RFDR) спектры.RFDR спектрында күзәтелгән Cα / Cβ калдыкларының үзара бәйләнеше модель пептид химик сменалары һәм статистикадан алынган кыйммәтләр һәм аларның икенчел структуралары белән чагыштырганда билгеләнде.SSB - әйләнүче кырый.в 15N-HSQC 10 мг / мл НТ эремәсенең бер үлчәмле спектры, 37 ° C инкубация вакытында 36 сәгать.Инсетта вакыт белән чагыштырганда күләмле интенсивлык күрсәтелә.d НТ гидрогелларының каты дәүләт RFDR спектры.Cα / Cβ калдыкларының корреляцияләре һәм аларның икенчел структуралары RFDR спектрында күзәтелә.e Zipper базасыннан NT45.79 фибриллация тизлеге профиленә нигезләнеп (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Гексапептидның киң яшен сменасы тәрәзәсенең Росетта энергиясе ккал / молда күрсәтелә.Кызыл барлар югары фиброз тизлеге белән гексепептидларны белдерәләр (Росетта энергиясе -23 ккал / молдан түбән; нокта сызыгы астында).Яшел барлар Росетта энергиясе булган фрагментларны күрсәтәләр, шуңа күрә стерик фермерлар барлыкка килү ихтималы аз.Пролин булган фрагментлар анализдан чыгарылды (баганасыз).Квадратлар Вальс алгоритмы белән алдан әйтелгән амилоидоз өлкәләрен күрсәтәләр (https://waltz.switchlab.org).НТ аминокислота калдыкларының эзлеклелеге иң өстендә, һәм β икенчел структурада табылган калдыкларның төрләре (каты дәүләт NMR спектроскопиясе белән билгеләнә) кызыл төстә күрсәтелә.Биш NT α-шакмакның позициясе (H1-H5) 28 итеп билгеләнгән.
PH <6.5, HT димерлаша, җылылыкка яки карбамид белән эшләнгән денатурациягә каршы тора18.НТ димеризациясе һәм тотрыклылыгы геляциягә ничек тәэсир итә икәнен ачыклау өчен, 100 мг / мл НТ булган эремәләр pH 8, 7, һәм 6 касә инверсия тесты ярдәмендә контрольдә тотылды.PH 8 һәм 7 инкубацияләнгән NT үрнәкләре 30 минуттан соң 37 ° C тәңгәлләнде, ләкин pH 8 гел ачык булып калды, pH 7 гел күренеп торган явым-төшем күрсәтте (5а рәсем).Киресенчә, pH 6 булган HT булган эремә гель формалаштырмады, һәм зур явым-төшем 20 минуттан соң 37 ° C ка күренергә мөмкин.Бу шуны күрсәтә: мономерлар белән чагыштырганда, үзләрен һәм / яки аларның югары тотрыклылыгы геляцияне булдырмый.PH 7 һәм 6-да NT өчен явым-төшем барлыкка килү көтелмәгән, чөнки НТ 200 мг / мл27дә эри, җылылык денатурасыннан соң җиңел үзгәрә, һәм түбән кыйммәтләрдә α-геликсны саклый. pH 18. Бу каршылыкларның ихтимал аңлатмасы шунда: алдан хәбәр ителгән экспериментлар бүлмә температурасында яки түбәндә, яки чагыштырмача түбән протеин концентрацияләрендә16,18,19.
37 ° C инкубациядән соң NT 8 шешә инверсия тесты (100 мг / мл) pH 8, 7, 6 һәм 154 мм NaCl (pH 8).b NT CD спектры, тиешенчә, 154 мм NaF һәм 154 мм NaCl белән.222 нм моляр эллиптикасы табигый катлам пропорциясенә әверелә.c НТ инверсия анализы (100 мг / мл) NT * (37 ° C һәм 60 ° C), NTA72R (37 ° C), һәм His-NT-L6 (37 ° C һәм 60 ° C).d NT *, NTA72R, һәм His-NT-L6 мутацияләренең CD спектры.222 нм моляр эллиптикасы табигый катлам пропорциясенә әверелә.e NTFlSp, NTMiSp инверсия тесты һәм NTMiSp (100 мг / мл) киметелде.Масштаб бар 5 мм.f NT, NTFlSp, NTMiSp CD спектры һәм NTMiSp киметелде.222 нм моляр эллиптикасы табигый катлам пропорциясенә әверелә.25 ° C һәм 95 ° C тулы NT спектры өстәмә рәсемдә күрсәтелгән.
Физиологик тоз концентрациясе НТ субунитлары белән электростатик үзара бәйләнешне һәм түбән pH18гә НТ тапшыруның димеризациясен билгели.Без 154 мм NaCl һәм NaF булуы чыннан да геляцияне тыя (5а, б; өстәмә рәсем 2б) һәм бу тозлар НТ мономерларының җылылык тотрыклылыгын арттырганнарын ачыкладык (5б рәсем, өстәмә рәсем 8). .Бу шулай ук ​​тотрыклылыкны арттыру, димеризация түгел, гель формалашуга комачаулый.
Протеин димеризациясе һәм геляциядә тотрыклылык ролен тагын да күбрәк өйрәнү өчен, без ике мутант кулландык, NT * һәм NTA72R, алар түбән pH28.30да мономер булып кала.NT * - икеләтә корылма кире мутант, монда мономерның күренгән диполар корылмасы бүленеше тигезләнгән, бу димеризациядән саклый һәм мономерның тотрыклылыгын кискен арттыра.NTA72R - зарядлы дипол, ләкин Арг белән алмаштырылган Ала димер чикләрендә урнашкан, шуңа күрә мутацияләр димеризация өчен кирәк булган субунит үзара бәйләнешкә комачаулый.37 ° C инкубациядән соң, NT * гидрогель формалаштырмады, NTA72R 15 минут эчендә ачык булмаган гель ясады (5с рәсем).Н.Бу шулай ук ​​HT * гельнең югары температурада тотрыксыз булганда формалашуы белән раслана (8 минуттан соң 60 ° C; 5с рәсем).Элегерәк күрсәтелде, НТтагы метионинның югары эчтәлеге аның табигый катламын сыекландыра һәм алты Met-Leu алмаштыручысы (монда His-NT-L6 дип атала) NT46 мономерын нык тотрыклыландыра.НТ гел формалашу өчен структур сыгылучылык кирәк дигән фаразга нигезләнеп, без His-NT-L6 тотрыклы мутантның 37 ° C температурада килмәвен ачыкладык (рәсем 5c, d).Ләкин, His-NT-L6 шулай ук ​​60 минутта 60 минутта инкубациядән соң гель барлыкка китерде (5с рәсем).
НТ-ның структураларга әверелү һәм гидрогеллар формалаштыру сәләте кайбер спидроинның НТ доменнарына кагылмый.Төрле ефәк төрләрдән һәм үрмәкүч төрләреннән булган НТлар, Трихонефила клавипалары (NTFlSp), чагыштырмача түбән метионин һәм югары җылылык тотрыклылыгына карамастан, гельләр барлыкка китерделәр (5e рәсем, f һәм өстәмә таблица 2).Моннан аермалы буларак, аз җылылык тотрыклылыгы һәм югары метионин эчтәлеге булган Аранеус вентрикосыннан (NTMiSp) кечкенә ампуллар белок спидроиныннан НТ гидрогеллар формалаштырмады (өстәмә таблица 2 һәм рәсем 5e, f).Соңгысы күзәнәк эчендәге диффид бәйләнешләре белән бәйле булырга мөмкин29,47.Даими рәвештә, NTMiSp диффид бәйләнешләре кимегәндә, ул 10 минут эчендә 37 ° C инкубациядән соң гидрогель барлыкка китерде (5e рәсем).Ахырда, шуны әйтергә кирәк: структур сыгылучылык НТтан гель формалаштыру критерийы мөһим, ләкин бердәнбер түгел.Тиешле булырга мөмкин тагын бер фактор - амилоид фибриллар формалашу тизлеге, һәм фермер базасы һәм Вальс алгоритмы белән анализ гель формалаштыру сәләте белән амилоидоген регионнары, шулай ук ​​фаразланган төбәкләр арасындагы бәйләнешне күрсәтте. стерик фермерлар формалаштыру.Корреляция бар иде (өстәмә таблица 2 һәм өстәмә рәсем 9).
НТның фибриллар формалаштыру һәм уңайлы шартларда гель формалаштыру сәләте безне фаразларга этәрде, башка протеин фрагментлары белән НТ кушылмалары әле дә кушылу партнерларының тулы функциясе белән гель формалаштыра ала.Моны сынап карау өчен, без яшел флуоресцент белок (GFP) һәм пурин нуклеозид фосфорилаза (PNP) НТ C-терминусында керттек.Нәтиҗә ясалган протеиннар Э.Колида бик югары йомгак белән күрсәтелде (150 мг / L һәм 256 мг / L фласс культураларын His-NT-GFP һәм His-NT-PNP өчен), күрсәтелгәннәргә туры китереп. Башка протеиннар өчен NT Ref.30. Аның-NT-GFP (300мг / мл) һәм His-NT-PNP (100мг / мл) кушылу протеиннары 2 сәгать 6,5 сәгатьтән соң 37 ° C температурада гель барлыкка китерделәр, һәм иң мөһиме, GFP өлеше үзгәрешсез калды.геляциядән соң күзәтелә, башлангыч флюоресенция интенсивлыгының 70% ы геляциядән соң кала (6а рәсем).Аның-NT-PNP эремәләрендә һәм гельләрендә PNP эшчәнлеген үлчәү өчен, без кушылу протеинын НТ белән эретергә тиеш идек, чөнки саф әзерлекнең энзиматик активлыгы гелл концентрацияләрендә анализны ачыклау диапазоныннан читтә иде.0,01 мг / мл His-NT-PNP һәм 100 мг / мл НТ катнашмасы белән барлыкка килгән гель принкубацияләнгән үрнәкләрнең башлангыч энзиматик активлыгының 65% саклаган (6б рәсем).Гель үлчәү вакытында сакланып калган (өстәмә рәсем 10).
His-NT-GFP (300 мг / мл) геляцияләнгәнче һәм аннан соң чагыштырма флюоресенция интенсивлыгы һәм күренгән һәм UV нуры астында His-NT-GFP гидрогелы (300 мг / мл) булган инверсия шешә.Нокталар индивидуаль үлчәүләрне күрсәтәләр (n = 3), хаталар барлары стандарт тайпылышны күрсәтәләр.Уртача кыйммәт хата юлларының үзәгендә күрсәтелә.b PNP эшчәнлеге фторометрик анализ ярдәмендә НТ (100 мг / мл) һәм 0,01 мг / мл аның-NT-PNP һәм 100 мг / мл Яңа Тайвань доллары булган катнашма ярдәмендә алынган.Инсетта His-NT-PNP (5 мм масштаблы штрих) булган гидрогел булган инверсия касә күрсәтелә.
Монда без НТ һәм башка рекомбинант спидроин белокларыннан гидрогеллар барлыкка килүен хәбәр итәбез, 37 ° C протеин эремәсен инкубацияләп (1 нче рәсем).Без күрсәтәбез, геляция α-шакмакларның β катламына әверелүе һәм амилоид сыман фибриллар формалашуы белән бәйле (3 һәм 4 нче рәсемнәр).Бу табышмак гаҗәпләндерә, чөнки НТлар глобуляр биш геликс туплагычлары, бик югары эрүчәнлеге һәм концентрацияләрдә югары тотрыклылыгы белән билгеле> 200 мг / мл берничә көн дәвамында 4 ° C27.Моннан тыш, NT-ларда аз протеин концентрацияләрендә җылылык денатурациясеннән соң НТлар тиз арада әйләнеп кайталар.Безнең нәтиҗәләр буенча, фибрил формалашуы> 10 мг / мл белок концентрациясе һәм бераз күтәрелгән температураның кушылуын таләп итә (1 нче рәсем).Бу амилоид фибрилларның физиологик шартларда җылылык үзгәрүләре аркасында өлешчә ачылмаган хәлдә булган глобуляр катланган аксымнардан барлыкка килергә мөмкинлеге турындагы фикер белән туры килә.Бу конверсия үткән аксымнар мисалларына инсулин 49,50, β2-микроглобулин, транстиретин һәм лизозим51,52,53 керә.НТ туган илендә he-геликс булса да, полипептид чылбырының якынча 65% стерик фермер формалашу белән туры килә (4e рәсем) 45.Мономер динамик хәрәкәттә булганлыктан, ул бу потенциаль амилоидоген өлкәләрне уртача күтәрелгән температурада фаш итә ала һәм гомуми протеинның югары концентрациясендә амилоид фибрил формалашу өчен критик концентрациягә ирешә ала54.Бу фикер йөртүдән соң, без спидроин концентрациясе һәм геляция вакыты арасында тискәре бәйләнеш таптык (1с рәсем), һәм мономерик НТ конформациясе мутацияләр ярдәмендә тотрыклыланса (NT *, His-NT-L6) яки тоз өстәү аркасында, гидрогеллар формалаштыру (5 нче рәсем).
Күпчелек очракта амилоид фибриллар эремәдән явым-төшем булып юкка чыга, ләкин кайбер шартларда алар гидрогель 555,56,57 барлыкка китерергә мөмкин.Гидрогел формалаштыручы фибриллар гадәттә югары аспектка ия ​​һәм молекуляр бәйләнеш аша тотрыклы өч үлчәмле челтәрләр формалаштыралар, безнең нәтиҗәләргә туры килгән 55,58.Витродагы гидрогел формалашу өчен, протеиннар еш кына тулы яки өлешчә ачылалар, мәсәлән, органик эреткечләргә, югары температурага (70–90 ° C) һәм / яки түбән pH (1.5–3.0) 59,60,61,62.Монда тасвирланган спидроин гидрогеллары каты эшкәртүне таләп итмиләр, һәм гидрогелларны тотрыклыландыру өчен үзара бәйләүче агентлар таләп итмиләр.
Элегерәк хәбәр ителгәнчә, ефәк әйләнү вакытында спидроин кабатлана һәм QDлар, гидрогеллар барлыкка китерәләр.Безнең ачышлар белән чагыштырганда, инкубация вакыты һәм / яки инкубация температурасы тиешенчә озынрак яки югарырак иде, һәм килеп чыккан гидрогеллар еш кына ачык булмаган (7 нче рәсем һәм өстәмә таблица) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Тиз гель вакытына өстәп, НТ гидрогеллары> 300 мг / мл (30%) рекомбинант үрмәкүч ефәк белок гидрогелларыннан, шулай ук ​​гелатин, алгинат (2%), агар (0,5%) ) һәм коллаген.(0,6%) (7 нче рәсем һәм өстәмә таблицалар 1 һәм 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Бу тикшеренүдә гидрогелларның гель вакыты һәм эластик модуласы башка спидроинга нигезләнгән гидрогеллар һәм сайланган табигый гидрогеллар белән чагыштырылды.Белешмәләр геляция шартларын тасвирлау белән бергә бирелә.АПС Аммоний персульфаты, бүлмә температурасы.37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Spрмәкүчләр саклау вакытында спидроинны эретүдән саклап калу ысулларын уйлап таптылар.Ефәк бизендә протеинның зур концентрациясенә карамастан, терминал домены белән бәйле зур кабатлау өлкәсе, бу тикшерү чикләрендә НТ һәм КТның концентрациясе якынча 10-20 мг / млга туры килүен аңлата.витро күзәтелгән гидрогел формалашу өчен кирәк.Моннан тыш, 16 тозның охшаш концентрацияләре ефәк бизләрдәге кебек тотрыклы НТ (5б рәсем).НТ конформациясе E. coli цитосолында өйрәнелгән һәм витрода тикшерелгәнгә караганда катырак катланган, бу тагын тоз яки башка факторларның вивода агрегатына комачаулаганын күрсәтә.Ләкин, НТларның фибрилларга әверелү сәләте филамент формалашу өчен мөһим булырга мөмкин һәм киләчәк тикшеренүләрдә тикшерелергә тиеш.
Бу тикшеренүдә күзәтелгән НТ-амилоид сыман фибрил һәм гидрогел формалашуның яңа аспектларына өстәп, без шулай ук ​​бу күренешнең биотехнологик һәм биомедицина кулланмалары булырга мөмкинлеген күрсәтәбез (8 нче рәсем).Концепция дәлиле буларак, без NTны GFP яки PNP белән берләштердек һәм кушылу протеинының 37 ° C инкубацияләнгәндә гидрогеллар барлыкка килүен һәм GFP һәм PNP фракцияләренең геляциядән соң активлыгын саклап калуларын күрсәттек (6-нчы рәсем).Нуклеосид фосфорилазлары - нуклеозид аналогларының мөһим катализатор синтезы75, бу безнең ачышны биофармацевтика индустриясе өчен актуаль итә.Уңай шартларда ачык гидрогелларны формалаштыручы кушылма протеиннарын белдерү төшенчәсе функциональ гидрогелларны ясарга мөмкинлек бирә, ферментларны иммобилизацияләү, контрольдә тотылган наркотиклар чыгару һәм тукымалар инженериясе кебек киң кулланылыш өчен.Моннан тыш, NT һәм NT * эффектив белдерү маркерлары30, димәк, НТ һәм аның вариантлары эри торган кушылу протеиннарын югары җитештерү өчен һәм 3D гидрогелларда имобилизацияләнгән максатлы протеиннар булдыру өчен кулланылырга мөмкин.
НТ эри, hel-гелик һәм түбән концентрацияләрдә (µM) һәм 37 ° C.Шул ук температурада, ләкин концентрацияләр артканда (> 10 мг / мл), НТ амилоид сыман фибриллардан торган гельләр барлыкка китерә.Н.Түбәндә: NT (PDB: 4FBS) һәм җепсел челтәрләренең иллюстрацияләре һәм протеин структуралары (фаразланган һәм масштабка тартылмаган, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210 / pdb2B3Q / pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210 / pdb4RJ2 / pdb).
Конструкцияләр (аминокислота эзлеклелеген кертеп, тулы исемлек өчен өстәмә таблицаны карагыз) pT7 плазмидына клонланган һәм E. coli BL21 (DE3) итеп үзгәртелгән.Электрон плазмидлар булган Э.Коли Лурия камырына прививка ясалган, канамицин (70 мг / л) белән тулыландырылган һәм төнлә 30 ° C һәм 250 әйләнештә үскән.Аннары культура канамицин булган LB уртага 1/100 прививка ясалган һәм OD600 0,8гә кадәр 30 ° C һәм 110 минутта культураланган.NMR тикшеренүләре өчен, бактерияләр M9 минималь уртада 2 г Д-глюкоза 13C (Алдрич) һәм изотоплар белән протеин маркировкасы өчен 1 г аммиак хлорид 15N (Кембридж Изотоп Лабораторияләре, Inc) булган.Температураны 20 градуска кадәр төшерегез һәм 0,15 мм изопропилтиогалактопиранозид (соңгы концентрация) белән протеинны күрсәтегез.Төнге протеин белдерүеннән соң, күзәнәкләр 7278 × г, 4 ° C 20 минутта җыеп алындылар.Күзәнәк шакмаклары 20 мм Tris-HCl, pH 8 белән реанимацияләнде һәм алга таба кулланылганчы туңдырылды.Эретелгән күзәнәкләр 30 кПа күләмендә күзәнәк өзгеч (TS серияле машиналар, Констант Системалар Лимитед, Англия) ярдәмендә лизизланган.Аннары лизатлар 25000 г температурада 30 минутта 4 ° C температурада центрификацияләнде.Н. 30 мин.Супернатант Ni-NTA баганасына төялеп, 20 мм Tris-HCl, 2 мм имидазол, pH 8 белән юылды, һәм ниһаять, протеин 20 мм Tris-HCl, 200 мм имидазол, pH 8. NT2RepCT һәм NTCT, тромбин ашкайнату сайты (ThrCleav) аның һәм НТ арасында таныштыра.Тромбин ярылу урыннары аның His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep җитештерә), Хис-тиоредоксин-ThrCleav-NT (НТ җитештерә), Хис-тиоредоксин-ThrCleav-CT (CT җитештерә), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT бар. .*.Конструкцияләр тромбин (1: 1000) белән эшкәртелде һәм төнлә 4 ° C температурада 20 мм Tris-HCl, pH 8 белән диализлаштырылды, 6-8 kDa молекуляр авырлык бусагасы булган Спектра / Пор диализ мембранасы ярдәмендә.Диализдан соң, эремә Ni-NTA баганасына куела һәм кызыксыну протеины булган агып чыга.Протеин концентрацияләре UV сорылуын 280 нм үлчәп, һәр протеинның юкка чыгу коэффициентын кулланып билгеләнде, җитештерүче протоколы буенча Брэдфорд анализын кулланган NTF1Spдан кала.Чисталык SDS полиакриламид (4–20%) гель электрофорезы һәм Coomassie якты зәңгәр буяу белән билгеләнде.Аксымнар центрифуга фильтрлары ярдәмендә тупланганнар (VivaSpin 20, GE Healthcare) 4000 xg тәэсирендә, 10 минутлык молекуляр авырлык 20 минут циклда.
Протеин эремәсен эретегез һәм 150 µлны 1 мл чиста септум касәсенә (8 x 40 мм Термо Фәнни) кертегез.Трубалар парга әйләнсен өчен парафильм белән мөһерләнгәннәр.Nрнәкләр (n = 3) 37 ° C яки 60 ° C инкубацияләнде һәм геляцияне күзәтү өчен вакыт-вакыт инверсияләнде.Гел булмаган үрнәкләр ким дигәндә бер атна инкубацияләнде.10 мм протеинга 10 мм DTT белән NTMiSp диффид бәйләнешләрен киметү.Табигый үрмәкүч ефәк капламаларның геляциясен анализлау өчен, Швеция күпере үрмәкүч киселде, ике төп ампуляцияләнгән биз 200 мм 20 Tris-HCl буфер pH 8 урнаштырылды һәм каплау бездән аерылсын өчен киселде..Безнең эчтәлеге буферда эретелә, коры авырлыкны билгеләү өчен 50 µл (ачык шешәләрне 60 ° C даими авырлыкка инкубацияләү белән) һәм 37 ° C температурада 150 µл.
Geлчәү геометриясе / коралы параллель тәлинкә ярдәмендә 20 мм диаметрлы һәм 0,5 мм бушлык белән параллель корычтан эшләнгән.Ampleрнәкне 25 ° C -тан 45 ° C-га кадәр һәм 25 ° C-ка кире кайтыгыз, минутына 1 ° C температурада, тотрыксыз корыч асты Пельтиер тәлинкәсе ярдәмендә.Тибрәнү үлчәүләре 0,1 Гц ешлыгында һәм материалның сызыклы вискоэластик өлкәсендә 100 мг / мл һәм 300-500 мг / мл үрнәкләре өчен 5% һәм 0,5% штаммында үткәрелде.Парлану өчен махсус дым камерасын кулланыгыз.Призма 9 ярдәмендә мәгълүматлар анализланды.
Бүлмә температурасында инфракызыл (ИР) спектрын җыю өчен 800 - 3900 см - 1.АТР җайланмасы, шулай ук ​​спектрометр аша яктылык юлы, эксперимент алдыннан һәм коры фильтрланган һава белән чистартыла.Чишелешләр (спектрдагы су сеңдерүне киметү өчен 500 мг / мл) кристаллларга җибәрелде, һәм гельләр (500 мг / мл) үлчәү алдыннан формалаштылар, аннары кристаллларга күчерелде (n = 3).1000 сканер 2 см-1 резолюциясе һәм 2 нуль дежур циклы белән яздырылды. Икенче туем OPUS (Bruker) ярдәмендә тугыз нокта тигезләү диапазоны ярдәмендә исәпләнде.Спектрлар 1720-1580 см-1 арасында бер үк интеграция өлкәсенә нормальләштерелде, Ф.Менгес "Спектрагриф - оптик спектроскопия программасы" ярдәмендә.АТР-ИР спектроскопиясендә, инфракызыл нурның үрнәккә үтеп керү тирәнлеге дулкынга бәйле, нәтиҗәдә түбән дулкыннарда көчлерәк үзләштерүгә китерә.Бу эффектлар Рәсемнәрдә күрсәтелгән спектрлар өчен төзәтелмәгән.3 чөнки алар бик кечкенә (өстәмә рәсем 4).Бу сан өчен төзәтелгән спектрлар Bruker OPUS программа ярдәмендә исәпләнде.
Принципта, протеин конфигурацияләренең комплекслы күләме I иң югары ноктада компонентларның ышанычлы деконволюциясеннән соң мөмкин.Ләкин практикада кайбер киртәләр барлыкка килә.Деконволюция вакытында спектрдагы тавыш (ялган) иң югары булып күренергә мөмкин.Моннан тыш, су бөкләнү аркасында иң югары нокта I амид позициясенә туры килә һәм монда өйрәнелгән су гели кебек күп күләмдә су булган үрнәкләр өчен охшаш зурлыкка ия ​​булырга мөмкин.Шуңа күрә, без иң югары ноктада тулысынча таркалырга тырышмадык, һәм безнең күзәтүләр NMR спектроскопиясе кебек башка ысуллар ярдәмендә каралырга тиеш.
50 мг / мл NT һәм His-NT2RepCT эремәләре төнлә 37 ° C температурада эретелде.Аннары гидрогель 20 мм Tris-HCl (pH 8) белән 12,5 мг / мл концентрациясенә эретелде, яхшы селкенде һәм гельне сындыру өчен торбага салынды.Аннары, гидрогель 20 мм Tris-HCl (pH 8) белән 10 тапкыр эретелде, 5 μл үрнәк формвар белән капланган бакыр челтәренә кулланылды, артык үрнәк кәгазь белән алынды.Samрнәкләр 5 µл МиллиQ суы белән ике тапкыр юылды һәм 5 минут эчендә 1% уранил форматы белән буялды.Артык тапны сеңдергеч кәгазь белән алып ташлагыз, аннары һаваны киптерегез.100 кВта эшләүче FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN ярдәмендә бу челтәрләрдә сурәтләү эшләнде.Рәсемнәр Veleta 2k × 2k CCD камерасы ярдәмендә x 26,500 һәм x 43,000 зурлыкта теркәлде (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Германия).Eachәрбер үрнәк өчен (n = 1) 10-15 рәсем язылды.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) рәсем анализы һәм җепсел диаметрларын үлчәү өчен кулланылды (n = 100, төрле җепселләр).Призма 9 яраксыз т-тестлар үткәрү өчен кулланылды (ике койрыклы).Аның-NT2RepCT һәм NT фибриллары уртача 11,43 (SD 2.035) һәм 7.67 (SD 1.389) nm булган.Ышаныч интервалы (95%) -4.246 -3.275.ирек дәрәҗәләре = 198, б <0.0001.
10 µM тиофлавин T (ThT) булган 80 µл сыеклык үрнәкләре өчпочмакта (n = 3) статистик шартларда Corning 96 кое кара төбе ачык аскы тәлинкәләр ярдәмендә үлчәнде (Corning Glass 3881, АКШ).Флуоресцент аермалар 440 нм дулкынландыргыч фильтр һәм 480 нм чыгару фильтры ярдәмендә теркәлде (БМГ Лабтехтан FLUOStar Galaxy, Оффенбург, Германия).ThT сигналы туендырылмады һәм сүндерелмәде, чөнки ThTның төрле концентрацияләре белән экспериментлар сигнал интенсивлыгын үзгәртмичә үткәрелде.Томан үлчәү өчен 360 нм тизлектә үзләштерүне языгыз.Орлык экспериментлары өчен 100 мг / мл гель 37 ° C тәшкил итте, реанимацияләнде һәм 5%, 10%, һәм 20% күләмендә чәчү өчен кулланылды.Призма 9 ярдәмендә мәгълүматлар анализланды.
Аның-NT2RepCT һәм NT запасларын эретегез> бозда 100 мг / мл һәм 0,22 мм фильтр аша фильтр.Концентрацияләр Нанодроп ярдәмендә 280 нм га сеңдерүне үлчәү белән исәпләнде.Ачык төбе булган 96 кое кара бәйләүче тәлинкә коеларында, үрнәкләр 20 мм Tris-HCl pH 8дә 20 мг / млга эретелгән һәм 5 μM ThT (соңгы концентрация) белән кушылган, гомуми үрнәк концентрациясе 50 μл күләм.10рнәкләр 10 минут саен 37 ° C температурада CellObserver (Zeiss) микроскопында яктыртылган канал һәм FITC дулкынландыру һәм ThT картинасы өчен эмиссия фильтр комплектлары белән сурәтләнде.Тасвирлау өчен 20х / 0,4 линза кулланыла.Рәсем анализы өчен Zen Blue (Zeiss) һәм ImageJ (https://imagej.nih.gov/) кулланылды.Гель шулай ук ​​NT һәм His-NT2RepCT эремәләреннән 50 мг / мл концентрациясендә 20 мм Tris pH 8 һәм 5 µM ThT булган һәм 37 минутта 90 минутта инкубацияләнгән.Гель кисәкләре 20 мм Tris, pH 8, һәм 5 μM ThT булган яңа коега күчерелмәгән кара 96 кое чиста тәлинкәгә күчерелде.20х / 0,4 зурлыкта яшел флюоресенция һәм якты кыр рәсемнәрен алыгыз.ImageJ рәсем анализы өчен кулланылды.
NMR спектры чишелеше 310 К 600 МГц Bruker Avance Neo спектрометрында QCI Quadrupole резонансы Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) белән җиһазландырылган.13C, 15N белән язылган 10 мг / мл бертөрле протеин булган NMR үрнәкләре 20 мм Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w / v) NaN3, 5% DO (v / v), (n = 1) .PH 6.7-дә NT2RepCT-ның химик сменалары 15N-HSQC 2D спектрында иң югары 23не билгеләү өчен кулланылды.
Тылсымлы почмак әйләнүче каты NMR (MAS) спектры 13C, 15N маркалы гидрогеллар Bruker Avance III HD спектрометрында 800 МГц 3,2 мм 13C / 15N {1H} электронсыз тикшерү белән җиһазландырылган.277 К температурада үзгәрә торган температура газ агымы ярдәмендә үрнәк температурасы контрольдә тотылды, ике үлчәмле диполь әйләнү резонансы (DARR) 76 һәм радио ешлыкны тоташтыру (RFDR) 77 спектр MAS ешлыкларында 12,5 кГц һәм 20 кГц ешлыкларында алынган.1H-dan 13C-га кадәр поляризация (CP) сызыклы пандус ярдәмендә 1H, 60,3 / 71,6 кГц 13C (12,5 / 20 kHz MAS) һәм контакт вакыты 0,5-1 мс.Мәгълүмат җыю вакытында 73,5 кГц спиналь 6478 декуплинг кулланылды.Сатып алу вакыты 10 миллисекунд, циклның тоткарлануы 2,5 секунд иде.RFDR спектрында күзәтелгән бер бәйләнгән Cα / Cβ корреляцияләре калдыклы типтагы химик сменаларга һәм DARR спектрындагы күп бәйләнешле корреляцияләргә нигезләнеп билгеләнде.
Zipper79 мәгълүмат базасы (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT, NTFlSp, NTMiSp өчен чуалыш тенденцияләрен һәм Розетта энергиясен бәяләү өчен кулланылды.Zipper базасы Rosetta Energy80-ны исәпли, ул протеин структурасын модельләштерү һәм анализлау өчен берничә ирекле энергия функциясен берләштерә.-23 ккал / мол яки түбән энергия дәрәҗәсе фибриллатка омтылышны күрсәтә.Түбән энергия фермер конформациясендә ике β кылның тотрыклылыгын аңлата.Моннан тыш, Вальс алгоритмы NT, NTFlSp һәм NTMiSp Ref амилоидоген өлкәләрен фаразлау өчен кулланылды.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Н.Соңгы протеин концентрациясе 100 мг / мл иде.
-Лчәүләр J-1500 CD спектрометрында (JASCO, АКШ) оптик юл белән 0,1 см булган 300 μL кветта ярдәмендә башкарылды.Аксымнар 20 мм фосфат буферында (pH 8) 10 μM (n = 1) белән эретелгән.Тоз булганда протеин тотрыклылыгын анализлау өчен, протеиннар шул ук концентрациядә (n = 1) 20 мм фосфат буферында (pH 8) 154 мм NaF яки NaCl булган анализланган.Температура сканерлары 222 нм 25 ° C дан 95 ° C ка кадәр, җылыту темплары 1 ° C / мин.Туган протеиннарның өлеше (KDmeasure - KDfinal) / (KDstart - KDfinal) формуласы ярдәмендә исәпләнде.Моннан тыш, һәр үрнәк өчен биш спектр 260 нм дан 190 нмга кадәр 25 ° C һәм җылытылганнан соң 95 ° C ка кадәр язылды.Биш спектр уртача, шомартылган һәм моляр эллиптикага әверелгән.Призма 9 ярдәмендә мәгълүматлар анализланды.
His-NT-GFP (300 мг / мл, 80 µЛ) флюоресенция интенсивлыгы статик шартларда кара кое төбе булган Corning тәлинкәләрендә өчпочмакта (n = 3) үлчәнде.395 нм дулкын озынлыгы булган флуоресцентлы тәлинкә укучысы белән үрнәкләрне үлчәгез һәм эмиссияне 509 нм геляциягә кадәр һәм 2 сәгатьтән соң 37 ° C.Призма 9 белән мәгълүматлар анализланды.
Пурин нуклеозид фосфорилаза эшчәнлеген анализлау комплекты (флюорометрик ысул, Сигма Алдрич) җитештерүче күрсәтмәсе буенча кулланылды.Гельләрдә һәм His-NT-PNP булган эремәләрдә активлыкны үлчәү өчен, 10 Нг Хис-НТ-ПНПны 100 мг / мл НТ белән гомуми күләм 2 µЛга кушыгыз, чөнки гель комплектны ачыклау интервалыннан югары сигнал биргән.Аның-NT-PNPсыз гельләр һәм чишелешләр өчен контрольләр кертелде.Measлчәүләр ике тапкыр үткәрелде (n = 2).Эшчәнлек үлчәнгәннән соң, реакция катнашмасы алынды һәм гель үлчәү вакытында гельнең өзлексез калуын тәэмин итү өчен фотога төшерелде.Призма 9 ярдәмендә мәгълүматлар анализланды.
Өйрәнү дизайны турында күбрәк мәгълүмат алу өчен, бу мәкалә белән бәйләнгән Табигатьне өйрәнү рефератын карагыз.
1 һәм 2 нче рәсемнәрдә башлангыч мәгълүматлар күрсәтелә.1c, 2a - c, 3a, b, e - g, 4, 5b, d, f, 6, өстәмә инҗир.3, өстәмә инҗир.5а, г, өстәмә инҗир.6 һәм өстәмә инҗир.8. Бу тикшеренүдән алынган мәгълүматлар Зенодо мәгълүмат базасында урнаштырылган https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Бу тикшеренүдә алынган NMR мәгълүматлары BMRBig складына bmrbig36 керү ID астында урнаштырылган.GFP һәм PNP структуралары PDBдан алынган (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Көтү, А. һәм Йоханссон, Дж. Ясалма үрмәкүч ефәк.Милли Химия.биология.11, 309-315 (2015).
Бабб, ПЛ һ.б.Нефила клавиплары геномы үрмәкүч ефәк геннарның төрлелеген һәм аларның катлаулы чагылышын күрсәтә.Милли Генетта.49, 895–903 (2017).