ASTM A790 2507/2205 1.4462 / 1.4410 Химия сәнәгатенең химик компоненты өчен дуплекс эретелгән труба, SPECC1L җитешмәве бүленгән буыннарның тотрыклылыгын арттыруга һәм краниаль нейр крест күзәнәкләренең түгүен киметүгә китерә.

Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт.Сез чикләнгән CSS ярдәме белән браузер версиясен кулланасыз.Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та туры килү режимын сүндерегез).Моннан тыш, дәвамлы ярдәмне тәэмин итү өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәбез.

ASTM A790 2507/2205 1.4462 / 1.4410 Химия сәнәгате өчен дуплекс эретелгән труба

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.Датсыз корычсыз торбалар, якты майланган торбалар, тотрыксыз күмелгән торбалар һ.б. буенча махсуслашкан әйдәп баручы җитештерүче.Клиентларны җиңеләйтү өчен, без торбаларны һәм трубаларны эретеп ябыштырдык.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.иң алдынгы җитештерү һәм сынау җиһазларына ия.Без сезнең таләпне тулысынча канәгатьләндерә алабыз.Стандарт бик катгый рәвештә, без җитештергән трубалар һәрвакыт дөрес OD һәм WT толерантлыгына ия.Толерантлык контроле стандартлар җитештерүгә туры килә.Безнең продуктлар клиентлардан һәрвакыт канәгать.Клиентлар безнең продуктларны сатып алдылар, күбрәк табыш китерделәр.
а) ОД (тышкы диаметр): 3,18 мм - 101,6 мм
б) ВТ (стенаның калынлыгы): 0,5 мм - 20 мм
в) Озынлык: клиент таләбе буенча
г) стандартлар: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 һ.б.
д) процесс ысулы: ERW, EFW һ.б.

Слайдка өч мәкалә күрсәтүче слайдерлар.Слайдлар аша хәрәкәт итү өчен арткы һәм киләсе төймәләрне кулланыгыз, яки һәр слайд аша хәрәкәт итү өчен ахырдагы слайд контроллер төймәләрен кулланыгыз.
Краниаль нейраль крест күзәнәкләре (CNCC) эмбрион нейрон катламнарын кысалар һәм урта структураларның күбесен тәшкил иткән фарингаль аркаларга күченәләр.CNCC дисфункциясе орофациаль ярылу этиологиясендә мөһим роль уйный, гомуми тумыштан килгән малформа.Гетерозигоз SPECC1L мутацияләре атипик һәм синдром ярыклары булган пациентларда табылды.Монда, без каноник ябыштыргыч тоташу (AJ) компонентларының, β-катенин һәм Э-кадеринның культуралы SPECC1L шакмакларында көчәйтелгән буяу турында хәбәр итәбез, һәм электрон микрографлар AJ-ның апикаль-базаль диффузиясен күрсәтәләр.Краниофациаль морфогенезда SPECC1L ролен аңлау өчен, без Specc1l җитешмәгән тычкан моделен булдырдык.Гомозигозлы мутацияләр эмбрион үлемгә китерә һәм бозылган нейр трубасын ябу һәм CNCC ламинациясен күрсәтә.Мутант нейрон катламнарында AJ протеины буяу арта.Бу AJ җитешсезлеге CNCC деламинациясендә җитешсезлек белән туры килә, AJ таркатуны таләп итә.Моннан тыш, Specc11 мутанты PI3K-AKT сигналын киметте һәм апоптозны арттырды.Витрода, кыргый типтагы күзәнәкләрдә PI3K-AKT сигнализациясен йомшак тыю AJ үзгәрешләрен кертү өчен җитәрлек иде.Иң мөһиме, SPECC1L бәрелү аркасында AJ үзгәртүләре PI3K-AKT юлын активлаштыру белән кире кайтарылырга мөмкин.Бергә тупланган бу мәгълүматлар SPECC1L, PI3K-AKT сигнализациясе һәм AJ биологиясенең яңа регуляторы буларак, нейрон торбаларын ябу һәм CNCC стратификациясе өчен кирәклеген күрсәтә.
Краниаль нейрон крест күзәнәкләре (CNCCs) дорсаль нейроектодермга локальләшәләр һәм эпителия-месенчималь күчү (EMT) процессы аша үсә торган нейрон катламнарының нейроепителиясеннән аерылалар 1,2,3.Эпителий CNCC-лар күченү күзәнәкләр арасындагы бәйләнешне бозалар һәм беренче һәм икенче фарингаль аркаларны тутырган һәм краниофациаль кариллажның күпчелек өлешен тәшкил итүче месенчималь CNCC-ларга әйләнәләр.Шулай итеп, CNCC функциясен җайга салучы геннар еш кына краниофациаль тумыштан килгән аномалия этиологиясендә өзелә, орофациаль ярыклар, гадәттә АКШ-ның 1/800 тууына тәэсир итә.Тумыштан килгән деформацияләрнең берсе8.
CNCC деламинациясе тычканнардагы эмбрион үсешенең 8,5 - 9,5 көн арасындагы нейрон трубасының ябылуына туры килә.Тычкан орофациаль ярылу белән бәйле геннарның мутацияләре шулай ук ​​Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, Pdgfrα12 кебек нейр трубасы җитешсезлеген күрсәтәләр.Ләкин, нейрон трубасын ябу һәм CNCC стратификациясе процесслары мөстәкыйль дип саналырга мөмкин, чөнки Splotch мутант тычкан (Pax3) CNCC стратификациясенә яки миграциясенә бернинди тәэсир итмичә, нейрон трубасын ябу кимчелекләрен күрсәтә.CNCC диссекциясендә һәм нейр трубасын ябуда җитешсезлекләр булган өстәмә тычкан модельләре бу ике процессның уртак молекуляр нигезен ачыкларга ярдәм итәчәк.
CNCC-ны нейроепителия күзәнәкләреннән изоляцияләү, E-кадерин, β-катенин, α-Е-катенин, һәм α-актинин актин филаментлары белән бәйле булган протеин комплексларыннан торган ябыштыргыч элементларны (AJ) таркатуны таләп итә. Нейр катламнарындагы Э-кадеринны чиктән тыш тикшерү CNCC деламинациясенең кимүен яки тоткарлануын күрсәтте.Киресенчә, Э-кадеринны бастыру иртә стратификациягә китерә15,16.CNCC стратификациясе вакытында EMT арадаш итүче факторларның күбесе транскрипция факторлары (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) һәм матрица металлопротеиназлары (ММП) кебек протеиннарны төзекләндерү белгечләре, ләкин CNCCлар туры циткелет AJ көйләүчеләре. әлегә билгеле түгел.PI3K-AKT юлы E-кадерин дәрәҗәсенә каршы тора, билгеле, рак тикшеренүләреннән.Соңгы тикшеренүләр күрсәткәнчә, тычканнарда PDGFα нигезендәге PI3K-AKT сигнализациясенең югалуы краниофациаль аномальлеккә китерә, шул исәптән тишек һәм нерв трубасы җитешсезлекләре12.Ләкин, PI3K-AKT юлы белән CNCC стратификациясе буенча AJ тотрыклылыгы арасындагы бәйләнеш аңлашылмый.
Элегерәк без SPECC1L-ны ике кешедә беренче мутант ген дип билгеләдек, ул авыздан күзгә кадәр сузылган, облифик ярык (ObFC) яки Tessier IV18 яры дип аталган.SPECC1L мутацияләре ике күпмилләтле гаиләдә ачыкланды, автосомаль доминант Opitz G / BBB синдромы (OMIM 145 145410), аларда гипердистанция һәм ирен / тәлинкә 19, һәм Тиби чиктән тыш синдромы булган бер гаиләдә (OMIM # 145420) 20 .Opitz G / BBB синдромы очракларының яртысыннан күбрәге X белән бәйләнгән (OMIM 300 300000) һәм MID1 гендагы мутацияләр аркасында килеп чыга, ул микротубул белән бәйле күзәнәк скелетының 22 протеинын кодлый.Без фаразлыйбыз, SPECC1L, шулай ук ​​микротубуллар һәм актин циткелетоны белән бәйле протеин, күзәнәк ябышу һәм миграция вакытында актин циткелетонын яңарту өчен кирәк булган сигналны арадаш итә ала.Витро һәм виво тикшеренүләре аша без хәзер SPECC1Lны PI3K-AKT сигнализациясе аша AJ тотрыклылыгының яңа көйләүчесе итеп тасвирлыйбыз.Кәрәзле дәрәҗәдә, SPECC1L дефициты пан-АКТ белок дәрәҗәсенең кимүенә һәм АКТның апикаль-базаль дисперсиясенең артуына китерде, бу АКТ юлының химик активлашуы белән бетерелде.Vivo, Specc11 дефицит яралгылар нейр трубасының ябылуын күрсәтә һәм CNCC диссекциясен киметә.Шулай итеп, SPECC1L бит морфогенезы вакытында нормаль CNCC функциясе өчен кирәк булган югары җайга салынган күзәнәк ябышу сигналында эшли.
SPECC1L ролен кәрәзле дәрәҗәдә характерлау өчен, без алда тасвирланган тотрыклы остеосаркома күзәнәк линиясе SPECC1L18 дефицитын кулландык.SPECC1L (kd) ноктасы булган бу тотрыклы U2OS күзәнәкләре SPECC1L транскрипцияләре һәм протеиннар дәрәҗәсендә уртача (60-70%) кимегән, актин цитоскелетонының миграция һәм үзгәртеп кору кимчелекләре белән. 18 Киресенчә, кискен вакытлыча кимү. SPECC1L 23 митотик җитешсезлекләргә китергәнен күрсәтте.Алга таба характеристика биргәч, без тотрыклы SPECC1L-kd күзәнәкләренең морфологияне бик югары кушылу дәрәҗәсендә үзгәрткәнен таптык (1 нче рәсем).Индивидуаль контроль күзәнәкләре һәм kd күзәнәкләре түбән кушылганда охшаш иде (1A, D).Берләшкәннән 24 сәгать үткәч, контроль күзәнәкләр кубоид формасын саклап калдылар (1Б, Е), SPECC1L-kd күзәнәкләре озынлыкта (1С, Ф).Күзәнәк формасындагы бу үзгәрешнең күләме контроль күзәнәкләрен һәм kd күзәнәкләрен турыдан-туры күзаллау белән төшерелде (кино 1).SPECC1L кушылган күзәнәкләрдә ролен ачыклау өчен, без аның экспрессиясен тикшердек.Без SPECC1L белок дәрәҗәсе кушылгач артканын ачыкладык (1G рәсем), ә SPECC1L транскрипция дәрәҗәсе артмады (1Х рәсем).Моннан тыш, күзәнәк тыгызлыгы арткан саен, SPECC1L протеины күзәнәкара чикләрдә тупланган (2A-E рәсем), мембраналар белән бәйле cat-катенин үрнәге белән капланган (2A'-E 'рәсем).SPECC1L актин циткелетон белән 18,23 ассоциациясен исәпкә алып, без SPECC1L актинга нигезләнгән ябыштыргыч тоташу (AJ) белән үзара бәйләнештә тора дип фаразладык.
(AF) SPECC1L бәрелү (DF) күзәнәкләре U2OS күзәнәкләрен (AC) контрольдә тоту белән чагыштырганда югары кушылуда (F) озын.Монда күрсәтелә, без төрле күзәнәк тыгызлыгы өчен сайлаган алты вакыт пунктының өчесе (T1, T3, T6).(G) Көнбатыш блот анализы күрсәтә, SPECC1L протеины контроль күзәнәкләрендәге түбән кушылу дәрәҗәсе белән чагыштырганда, югары кушылу дәрәҗәсендә тотрыклыланган.SPECC1L-ның көнбатыш блогы көтелгән 120 kDa диапазонын һәм югары молекуляр авырлык полосасын күрсәтә, мөгаен, тәрҗемәдән соң үзгәртелгән (*).Көнбатыш блот анализы түбән һәм югары кушылу өчен бер үк шартларда башкарылды.SPECC1Lны түбән һәм югары кушылуда күрсәтүче рәсемнәр бер үк блоктан алынган.Шул ук блок алынды һәм β-актин антителасы белән яңадан тикшерелде.(H) Санлы RT-PCR анализы SPECC1L транскрипция дәрәҗәсендә зур үзгәрешләр күрсәтмәде.Хата барлары дүрт бәйсез эксперименттан SEMларны күрсәтәләр.
(AE) Без күзәнәк формасы анализын һәм U2OS күзәнәкләрендәге AJ үзгәрүләрен SPECC1L ноктасы (kd) белән күзәнәк тыгызлыгын күрсәтүче алты вакыт ноктасын (T1-T6) сайладык.Бу вакыт пунктларының беренче бишлегендә бер күзәнәкләр (Т1), кечкенә күзәнәк кластерларының (T2) 50-70% кушылуы, kd күзәнәкләрен үзгәртмичә кушылу, kd күзәнәкләрен үзгәртү (T4) һәм 24 сәгать үзгәрешләр кертелде.kd (T5) күзәнәкләренең арткы формасында.SPECC1L протеины күбесенчә цитоплазмада T1 (A) таралды, ләкин аның туплануы киләсе вакыт нокталарында (В - Е, уклар) күзәнәкара чикләрдә күзәтелде.(FJ) cat-катенин AJ комплексы белән бәйләнгән күзәнәкара чикләрдә охшаш туплануны күрсәтә.(A'-E ') SPECC1L һәм β-катенин күзәнәк чикләрендә югары күзәнәк тыгызлыгында (уклар) бер-берсенә капланган тапларны күрсәтәләр.. үзгәрде.Барлар = 10 мм.
Аннары без SPECC1L дефицитының AJ тәэсирен ачыкларга тырыштык.Без AJ белән бәйле берничә маркер кулландык, алар арасында F-актин, миозин IIб, β-катенин һәм E-кадерин 24,25,26,27 каноник компонентлары.Актин стресс җепселләре алда әйтелгәнчә SPECC1L-kd күзәнәкләрендә артты (3A, B) 18.Актин филаментлары белән бәйләнгән миозин IIb витродагы SPECC1L-kd күзәнәкләренең охшаш үсешен күрсәтте (3C, D).AJ белән бәйле cat-катенин күзәнәк мембранасында кадеринга бәйләнә, контроль кубоцитларда гадәти "бал кортлары" экспрессия үрнәген күрсәтә (3E, G).Шунысы кызык, конфокаль микроскопия ярдәмендә яссы рәсемнәрдә β-катенин (3E, F) һәм Э-кадерин (3G, H) кушылган SPECC1L җитешмәгән күзәнәкләрнең күзәнәк мембранасында буяу киңәйтелгән буяуның күренекле үрнәкләрен күрсәттеләр.Kd күзәнәкләрендәге AJ белән бәйле cat-катенинның бу киңәюе кушылу вакытында иң ачык күренә, ләкин күзәнәк формасындагы үзгәрешләр алдыннан күренә (2F-J, F'-J ').Бу киңәйтелгән AJ буяуның физик табигатен ачыклау өчен, без электрон микроскопия (TEM) тапшыру аша SPECC1L-kd U2OS күзәнәкләренең апикаль-базаль өслегендә күзәнәк чикләрен тикшердек (3I рәсем, J).AJ (уклар) күрсәтүче электрон тыгыз төбәкләргә ия булган контроль күзәнәкләрдән аермалы буларак, kd күзәнәкләре (3J рәсем) апикобазаль яссылык буенча AJ-ның югары электрон тыгызлыгының зур, янәшә өлкәләрен күрсәттеләр..Моннан тыш, аркылы кисәкләрдә без kd күзәнәкләрендәге киң күзәнәк мембранасы катламнарын күзәттек (С1А, В), бу β-катенин һәм Э-кадерин буяу полосаларының киңәйтелгән үрнәген аңлата (3F, H).AJ-ларда SPECC1L ролен яклап, β-катенин кушылган U2OS күзәнәкләре лизаталарында SPECC1L белән бергә иммунопрекипатланган (3К рәсем).AJ маркерлары өчен киңәйтелгән иммунотация белән беррәттән, TEM анализы безнең гипотезага туры килде, SPECC1L дефициты AJ апикаль-базаль тыгызлыгын һәм вариантын арттыра.
(AH) Ф-актинның kd күзәнәкләрендә 48 сәгатьтән соң кушылуы артты (T6; A, B).F-актин (C, D) белән бәйләнгән миозин IIb үзгәртелгән буяу.SPECC1L-kd (F, H) күзәнәкләрендә control-катенин һәм Э-кадерин мембранасының шома үрнәге көчәйтелде.Барлар = 10 мм.(I - J) Апикаль-базаль күзәнәкара тоташуны күзәтүче электрон микрографлар.Контроль күзәнәкләр ябыштыргыч тоташуны күрсәтүче аерым электрон тыгыз төбәкләрне күрсәтәләр (I, уклар).Киресенчә, SPECC1L-kd күзәнәкләрендәге бөтен апикаль-базаль тоташу электрон тыгызлыкта (J, уклар) барлыкка килде, бу тыгызлыкның артуын һәм ябыштыргыч узышларның таралуын күрсәтә.(К) β-катенин SPECC1L белән кушылган U2OS күзәнәк лизаталарында иммунопрекипитацияләнде.Дүрт бәйсез экспериментның берсен күрсәтүче бер урыннан алынган рәсем.
Краниофациаль морфогенезда SPECC1L ролен аңлау өчен, без Specc1l дефицит тычкан моделен булдырдык, ике бәйсез ES тозак күзәнәк линиясе, DTM096 һәм RRH048 (BayGenomics, CA), алар интронны күрсәтәләр һәм Specc1l транскрипцияләре 15тә төшерелде (1 нче рәсем). .4А, С2 рәсем).Алданган вектор кыстыруның геномик урнашуы бөтен геном эзлеклелеге белән билгеләнде һәм PCR белән расланды (S2 рәсем).Ике ген тозак конструкцияләре шулай ук ​​Specc11-lacZ хәбәрчеләрен кулга алгач, берләштерергә мөмкинлек бирделәр.Шуңа күрә, X-гал буяу белән билгеләнгән lacZ экспрессиясе Specc11 экспрессиясе күрсәткече буларак кулланылды.Ике аллес та охшаш lacZ экспрессия үрнәкләрен күрсәттеләр, DTM096 ген тозагы белән 1-нче интронда RRH048-тан көчлерәк экспрессия күрсәттеләр (күрсәтелмәгән).Ләкин, Specc1l киң таралган, E8.5 (4Б рәсем) нейрон катламнарында, E9.5 һәм E10.5 (4C, D) нейрон трубаларында һәм бит процессларында аеруча көчле чагылыш таба. E10.5 һәм күзләр (рәсем 4D).Элегерәк хәбәр иттек, E10.5 тәүге фарингаль архада SPECC1L экспрессиясе эпителиядә һәм төп месенчим18 булган, CNCC нәселенә туры килгән.CNEC'та SPECC1L экспрессиясен сынап карау өчен, без E8.5 нейрон катламнарын (рәсем 4E-J) һәм E9.5 баш сөяге бүлекләрен эшләдек (4К- рәсем).E8.5-дә, SPECC1L нейраль катламнарны каты буяды (4E, H), шул исәптән NCC маркерлары белән буялган күзәнәкләр (4G, J).E9.5, SPECC1L (4K, N) көчле күчерелгән CNCC AP2A (4L, M) яки SOX10 (4O, P) белән кушылган.
(А) ES DTM096 (интрон 1) һәм RRH048 (интрон 15) күзәнәк клоннарында вектор кертүне күрсәтүче Specc11 ген тычканының схематик чагылышы.(BD) гетерозигозлы Specc1lDTM096 яралгыларның lacZ буяу E8.5 дән E10.5 кадәр Specc1l экспрессиясен күрсәтә.NE = нейроектодерм, NF = нейрон катламы, PA1 = беренче фарингаль аркасы..SPECC1L буяу E8.5 (E, H; ук башлары) нейрон катламнарында киң күзәтелде, шул исәптән AP2A (F, G; уклар) һәм SOX10 (I, J; уклар) белән язылган күзәнәкләр.E9.5 вакытында, SPECC1L күченүче CNCCларны (K, N; уклар) AP2A (L, M; уклар) һәм SOX10 (O, P; уклар) дип язылган.
Гетерозигозлы Specc1lDTM096 / + һәм Specc1lRRH048 / + тычканнар арасындагы кисешү ике ген тозак аллелының бер-берсен тулыландырмавын һәм ген тозак аллеле өчен кушылма гетерозиготалар һәм эмбрион гомозиготаларның эмбрион үлемгә китерүен күрсәтә (S1 таблицасы).Менделия коэффициентлары туганда гетерозиготаларның яшәү дәрәҗәсенең кимүен күрсәттеләр (көтелгән 1,34 vs. 2.0).Гетерозиготалар арасында перинаталь үлемнең түбән булуын күрдек, кайберләренең краниофациаль аномалияләре булган (С3 рәсем).Ләкин, бу перинаталь краниофациаль фенотипларның түбән үтеп керүе аларның төп патофизиологик механизмнарын өйрәнүне кыенлаштыра.Шуңа күрә без гомозигозлы Specc11 мутацияләренең эмбрион үлемгә китерүче фенотибына игътибар иттек.
Күпчелек катнаш гетерозигоз яки гомозигозлы Specc1lDTM096 / RRH048 мутант яралгылар E9.5-10.5 (5A - D рәсемнәреннән) үсмәгән, һәм нейрон трубасы тышкы яктан ябылмаган (5B, D рәсемнәр) һәм кайвакыт арткы ябык (күрсәтелмәгән). ..Бу краниаль нейр трубасын ябу җитешсезлеге CNCC күпчелек DLX2 белән билгеләнде, E10.5 нейрон катламнарында калган, бу аерылуны күрсәтми (5A'-D 'рәсем).CNCC-ның гомуми күләме дә кимегәнме-юкмы икәнен ачыклау өчен, без CNC сызыкларын GFP белән Wnt1-Cre һәм ROSAmTmG белән ген тозак линияләренә тамгаладык.Без GFP + NCC һәм GFP- (RFP +) NCC булмаган барлык яралгылардан сортлыйбыз.E9.5 дәрәҗәсендә, агымдагы сортлы GFP маркалы CNCCларның өлеше WT һәм мутант яралгылар арасында зур үзгәрмәде (күрсәтелми), бу гадәти CNCC спецификациясен күрсәтә.Шуңа күрә, без фаразладык, Wnt1-Cre һәм DLX2 калдыклары ачыкланган нейрон катламнарында (5Б рәсем) CNCC җитешсезлеге аркасында, мөгаен, SPECC1L-kd күзәнәкләрендә күренгәнчә, AJ күзәнәкләренең тыгызлыгы яки таралуы аркасында.Нейр катламында CNCC булуын раслау өчен NCC маркерларын SOX10, AP2A, DLX2 кулландык (5E-R рәсем).E8.5 вакытында, NCC өч маркеры өчен нейрон катлам буяу WT (5E, G, I) һәм Specc1l мутанты (5F, H, J) бүлекләрендә күзәтелде.E9.5 дәрәҗәсендә, NCC маркерлары WT бүлекчәләрендә күченүче NCC тап булганда (5M, O, Q), NCC калдыклары буяу Specc1l мутант яралгыларның нейрон катламнарында күзәтелгән (5N, P, R).SOX10 һәм DLX2 күченүче CNCCларны билгеләгәнгә, бу нәтиҗә SPECC1L җитешмәгән CNCCларның миграциядән соң спецификациягә ирешүен, ләкин нейрон катламнарыннан күченә алмавын күрсәтә.
Specc11 җитешсезлеге нейр трубасының җитешсезлегенә, краниаль нейрон крест күзәнәкләренең деламинациясенә китерә.
.Моннан аермалы буларак, Specc11 мутант яралгылар ачык нейрон катламнарын (В), ук башларын) һәм күчмәгән CNCCларны күрсәтәләр (В ', уклар)..WT E10.5 яралгыларында, DLX2-позитив CNCC гиль аркаларын (C ', уклар) колонизацияли, ә мутантларда ачык нейраль катламнарда (D', уклар) һәм беренче фарингаль аркаларда (D ', ачык). уклар).) CNCC-ның начар деламинациясен һәм миграциясен күрсәтүче кайбер буяу (уклар) белән.ER) E8.5 (E - L) һәм E9.5 (M - R) этапларында WT һәм Specc1l мутант яралгы бүлекчәләре NCC маркерлары SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) һәм DLX2 (I, J, Q, R).E8.5, NCC буяу кыргый типтагы нейрон катламында (NF) һәм мутант бүлекләрдә күзәтелде.E8.5 WT (K) һәм мутант (L) SOX10 һәм β-катенинның бергә кушылуы нейрон катламнарындагы күзәнәк чикләрендә β-катенинның артуын ачыклады.E9.5-та күченүче CNCC-ларның кыргый типтагы буяулары күзәтелде, Мутантларда, статизацияләнмәгән CNCC-лар ачык нейрон катламнарын тапладылар (N, P, R).(S - Z) WT һәм Specc11DTM096 / RRH048 эмбрионнарының E9.5 мутациясе белән виво AJ маркировкалау анализы.Уң өске почмакта якынча секция яссылыгы күрсәтелә.Мутант тукымалар бүлекләрендә F-актин (S, T) һәм миозин IIb (U, V) арту күзәтелә.3-нче рәсемдәге витро нәтиҗәләренә охшаган, мутант яралгыларда β-катенин (W, X) һәм E-кадерин (Y, Z) өчен көчәйтелгән мембраналар буяу күзәтелде..Моннан аермалы буларак, Specc11 мутант яралгы бүлекләрендә (BB, уклар), бөтен апикобазаль тоташу электрон тыгыз, бу тыгызлыкның артуын һәм ябыштыргыч узышларның таралуын күрсәтә.
Катламның кимүе үзгәртелгән AJ аркасында булган гипотезаны сынап карау өчен, без Specc1l мутант яралгыларның нейрон катламнарында AJ маркировкасын тикшердек (5S-Z рәсем).Без актин стресс җепселләренең артуын күзәттек (5S, T) һәм актин җепселләрендәге миоз IIB локализациясенең берләшкән артуы (5U, V рәсем).Иң мөһиме, без cell-катенинның (5W, X рәсем) һәм Э-кадеринның (5Y, Z) күзәнәкләр арасындагы чикләр артуын күрдек.Без шулай ук ​​E8.5 яралгыларның нейрон катламнарында NCC-cat-катенин буяуларын тикшердек (5К, Л).c-катенин буяу Specc1l мутант нейрон катламнарында көчлерәк булып күренде (5L һәм K), AJ үзгәрүләре башланганын күрсәтә.E9.5 яралгыларның баш сөяге бүлекләренең электрон микрографларында без Specc1l мутант яралгыларында WT белән чагыштырганда таралган диффузлы электрон-тыгыз буяуны күрдек (5AA, BB һәм S1E-H).Бергә туплангач, бу нәтиҗәләр безнең SPECC1L-kd U2OS күзәнәкләрендәге витро нәтиҗәләрне хуплый һәм безнең мутант эмбрионнарыбызда CNCC катламы алдыннан AJ буяу тәкъдим итә.
AKT эшчәнлеге белән E-кадерин тотрыклылыгы арасында билгеле антагонистик бәйләнешне исәпкә алып, 17,28 без PI3K-AKT сигнализациясенең катнашуын фаразладык.Моннан тыш, без кайбер мутант яралгыларда субепидермаль чәчәк атуны күзәттек, үлемнән (<5%) E9.5-10.5 тә кача идек һәм аның урынына E13.5 тирәсендә урнаштык (S3 рәсем).Субепидермаль весикулалар PDGFRα12 нигезендә PI3K-AKT сигнализациясенең билгесе.Фантаузо һ.б..Чыннан да, пан-АКТ һәм актив фосфориатланган Ser473-AKT дәрәҗәләре Specc1l мутан тукымаларында вивода E9.5 эмбрион кулга алынганга кадәр киметелде (6A-D рәсем).Фосфориатланган Ser473-AKT дәрәҗәсенең кимүе тулысынча пан-АКТ вивода (FIG. 6E) һәм витрода (FIG. 6F) кимү белән бәйле булырга мөмкин.Витро кимү U2OS күзәнәкләре күзәнәк формасының үзгәрүе һәм AJ тыгызлыгы белән тыгыз бәйләнгәндә генә күзәтелә (6D рәсем).Шулай итеп, безнең мәгълүматлар SPECC1Lның краниофациаль морфогенезда PI3K-AKT сигнализациясенең яңа уңай көйләүчесе булуын күрсәтә.
. , WT контроле белән чагыштырганда.Көнбатыш блотлау шул ук шартларда кыргый типтагы лизатларда һәм мутант лизатларда башкарылды.SPECC1L өчен күрсәтелгән рәсемнәр бер блоктан алынган.Шул ук блок алынды һәм анти-пан-ACT һәм β-актин антителалары белән яңадан тикшерелде.E8.5 нейрон катламнарында Pan-AKT дәрәҗәсе һәм E9.5 баш сөяге кисәкләрендәге фосфориатланган S473-AKT дәрәҗәсе сизелерлек кимеде.(F) Pan-AKT дәрәҗәсе шулай ук ​​югары кушылмада җыелган SPECC1L-kd U2OS күзәнәкләренең лизаталарында кимеде.Хата барлары өч мөстәкыйль Көнбатыш блот күләменнән SEMларны күрсәтәләр..Specc11 мутант яралгылар чагыштырма күзәнәк таралышын күрсәтәләр (I), ләкин апоптоз кичергән күзәнәкләр саны сизелерлек арта (J).
Аннары таралу һәм апоптоз билгеләрен тикшердек.Без E9.5 яралгыларның таралуында бернинди аерманы күзәтмәдек (6E, G I белән чагыштырганда), таралу индексы WT мутацияләре өчен 82,5% һәм KI67 буяу белән үлчәнгән Specc1l мутацияләре өчен 86,5% (p <0.56, Fisher's) төгәл тест).Нәкъ шулай ук, без апоптозның E8.5 нейрон катламнарындагы ярылган каспаз өчен буяу белән үлчәнгән аерманы күзәтмәдек, эмбрион кулга алынганчы (күрсәтелмәгән) (күрсәтелмәгән).Киресенчә, барлык E9.5 мутант яралгыларда апоптоз сизелерлек артты (6F, H һәм J).Апоптозның бу гомуми үсеше PI3K-AKT сигнализациясенең һәм эре эмбрион үлеменең 29,30,31 белән туры килә.
Алга таба, PI3K-AKT сигнализациясенең сәбәп ролен раслау өчен, безнең kd күзәнәкләрендәге үзгәрешләр, без контроль һәм kd күзәнәкләрендәге юлны химик яктан үзгәрттек (7A-F рәсем).Без маркер рәвешендә SPECC1L-kd кушылган күзәнәкләрдә күзәтелгән күзәнәк формасын үзгәртү фенотибын кулландык, без иң озын үлчәмнең (озынлыкның) тиешле вертикаль үлчәмгә (киңлек) нисбәтен кулланып бәяләдек.Чагыштырма түгәрәк яки кубоидаль күзәнәкләр өчен 1 нисбәте көтелә (7G рәсем).Күзәнәк формасына өстәп, без AJ тәэсирен β-катенин буяу белән расладык (7A'-F 'рәсем).Wortmannin кулланып PI3K-AKT юлын тыю контроль күзәнәкләрендәге күзәнәк формасын үзгәртү өчен җитәрлек иде (7A, C) һәм AJ (Рәсем 7A ').PI3K-AKT активлаштыручы SC-79 контроль күзәнәкләрендә күзәнәк формасына (FIG. 7A, E) яки AJ киңәюенә (FIG. 7A ') тәэсир итмәде.SPECC1L-kd күзәнәкләрендә PI3K-AKT юлын тагын да кысу апоптозның көчәюенә китерде (7Б, Д) һәм β-катенин буяу сизелерлек артты (7Б рәсем), безнең виво авыр мутацияләргә туры килә.Иң мөһиме, PI3K-AKT юлын активлаштыру күзәнәк формасын (рәсем 7B, F) һәм AJ фенотипларын яхшыртты (7Б рәсем).Күзәнәк формасының үзгәрүе күзәнәкнең түгәрәк коэффициенты (CCR) дип бәяләнде һәм югарыда күрсәтелгәнчә әһәмият өчен чагыштырылды (FIG. 7G).Чыннан да, контроль күзәнәкләрдә (рәсем 7G, CCR = 1.56), wortmannin белән эшкәртү күзәнәк формасын сизелерлек үзгәртү өчен җитәрлек булган (7G рәсем, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9). SPECC1L.-кд күзәнәкләре (7G рәсем, CCR = 3.46).SPECC1L-kd күзәнәкләрен Wortmannin белән эшкәртү (7G, CCR = 3.60, әһәмиятсез) дәваланмаган kd күзәнәкләреннән (7G рәсем, CCR = 3.46, әһәмиятсез) яки вортманнин белән эшкәртелгән контроль күзәнәкләрдән мөһимрәк түгел (7G рәсем)., CCR = 3.46, әһәмиятсез) өстәмә күзәнәкнең озынлыгына тәэсир итә (7G, CCR = 3.61, әһәмиятсез).Иң мөһиме, SC-79 AKT активаторы SPECC1L-kd күзәнәкләренең озын фенотибын торгызды (7G рәсем, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Бу нәтиҗәләр SPECC1L PI3K-AKT сигнализациясен көйли һәм SPECC1Lның уртача кимүе күзәнәк ябышуына тәэсир итә, ә көчле кимү апоптозга китерә (8 нче рәсем).
. Тазартылмаган контроль күзәнәкләр - кубоидаль (A), гадәти cat-мәче кәрәзле буяу (A '), ә kd күзәнәкләре озын (B) β-мәче буяулары белән (B').PI3K-AKT юлын бастырганнан соң, контроль күзәнәкләр (C) cat-мәче киңәюе (C ') белән озынлаштылар, ә kd күзәнәкләре апоптоз (D) кичерә башладылар, безнең югары мутацияләнгән яралгыларга охшаш һәм бик көчәйтелгән β-мәче күрсәтәләр.буяу (D ').PI3K-AKT юлын активлаштырганнан соң, контроль күзәнәкләр кубоидаль (E) булып калдылар һәм нормаль cat-мәче (E ') буяу булдылар, ә kd күзәнәкләре күзәнәк формасын (F) һәм β-мәче (F') буяуны күрсәттеләр, бу күрсәтә (G) (AF) күзәнәк формасының үзгәрү дәрәҗәсе иң озын үлчәмнең (озынлыкның) күзәнәкнең түгәрәкләнү коэффициентын һәм MetaMorph программасын кулланып тиешле вертикаль үлчәмне (киңлекне) кулланып бәяләнде.Тазартылмаган (NT) SPECC1L-kd күзәнәкләре (CCR = 3.46) контроль күзәнәкләренә караганда озынрак иде (CCR = 1.56, p <6.1 × 10–13).Вортның контроль күзәнәкләрдә PI3K-AKT юлын тыюы күзәнәк формасында охшаш озынлык тудыру өчен җитәрлек иде (CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9).Шулай ук, SPECC1L-kd күзәнәкләрендәге SC-79 тарафыннан AKT активлаштыру контроль дәрәҗәләргә күзәнәк озынлыгын торгызды (CCR = 1.74, p <6.2 × 10–12).SPECC1L-kd күзәнәкләрен Wortmannin белән дәвалау апоптозның көчәюенә китерде, ләкин күзәнәк формасының үзгәрүе (CCR = 3.60) эшкәртелмәгән kd (CCR = 3.46, ns) яки wortmannin белән эшкәртелгән контроль күзәнәкләр (3.61) белән чагыштырганда артмады.ns = мөһим түгел.+/- 50 күзәнәк өчен SEM үлчәүләре күрсәтелгән.Статистик аермалар Студентларның т-тесты ярдәмендә исәпләнде.
А) PI3K-AKT юлын тыю һәм активлаштыру схематик чагылышы, тиешенчә AJ үзгәрүенә һәм коткарылуына китерә.(B) SPECC1L тарафыннан АКТ протеинын тотрыклыландыру өчен тәкъдим ителгән модель.
Күчмә CNCCлар AJ лизисын тышкы нейрон катлам нейроепителия күзәнәкләреннән аеруны таләп итәләр1,15,32.AJ компонентларының буяуларын арттыру һәм витрода да, вивода да SPECC1L дефицит күзәнәкләрендә апикаль-базаль AJ асимметрик бүленешен югалту, SPECC1L β-катенинга физик якынлыгы белән берлектә, SPECC1L функцияләренең AJ җирле тотрыклылыгын дөрес саклау өчен эшләвен күрсәтә; оештыру мускуллары.актин циткелетон.SPECC1Lның актин циткелетоны һәм β-катенин белән берләшүе һәм SPECC1L булмаганда конденсацияләнгән актин филаментлары саны арту AJ тыгызлыгының күзәтелгән артуына туры килә.Тагын бер мөмкинлек - SPECC1L җитешмәгән күзәнәкләрдә актин җепселләренең саны арту күзәнәкләр арасындагы киеренкелекнең үзгәрүенә китерә.Кәрәзле стресс AJ 33 динамикасына тәэсир иткәнгә, көчәнеш үзгәрүләре AJ 34 таралуга китерергә мөмкин.Шуңа күрә теләсә нинди үзгәрешләр CNCC катламнарына тәэсир итәчәк.
Wnt1 нейрон крест күзәнәкләрен барлыкка китерүче эре нейрон катламнарында күрсәтелә.Шулай итеп, Wnt1-cre нәсел эзләү NCC35 алдыннан да, күченүдә дә билгеләр.Ләкин, Wnt1 шулай ук ​​35,36 эре нейрон катламнарыннан алынган дорсаль ми тукымасы клоннарын билгели, бу безнең ачык нейрон катламнарында Wnt1 маркерлары өчен E9.5 мутацияләрен буяу CNCC түгелдер.NCC маркерлары өчен безнең уңай буяу AP2A һәм SOX10 Specc11 мутант яралгыларның ачыкланган нейрон катламнарында CNCC булганын раслады.Моннан тыш, AP2A һәм SOX10 эре күченүче NCC билгеләре булганлыктан, уңай буяу бу күзәнәкләрнең миграциядән соңгы CNCC булуын күрсәтте, аларны E9.5 белән аерып булмый.
Безнең мәгълүматлар AEC-ның молекуляр көйләнешен SPECC1L PI3K-AKT сигнализациясе белән арадаш итүне күрсәтәләр.AKT сигнализациясе SPECC1L җитешмәгән күзәнәкләрдә һәм тукымаларда кими.Фантауззо һ.б. нәтиҗәләре.краниофациаль морфогенезда PI3K-AKT сигнализациясе өчен туры рольгә булышу.(2014) күрсәткәнчә, PDGFRα нигезендәге PI3K-AKT сигнализациясен активлаштыру булмавы ярык фенотибына китерә.Без шулай ук ​​PI3K-AKT юлын тыю AJ һәм U2OS күзәнәкләрендәге күзәнәк формасын үзгәртү өчен җитәрлек икәнен күрсәтәбез.Безнең ачышлар белән эзлекле, Кабил һ.б.37 күрсәткәнчә, PI3K α110 субунитын эндотелия күзәнәкләрендә дегрегуляцияләү перикеллюль cat-катенин буяуның охшаш артуына китерә, бу "тоташу индексы" арту дип атала.Ләкин, актин филаментлары инде югары оештырылган эндотелия күзәнәкләрендә, PI3K-AKT юлын кысу күзәнәк формасына китерә.Киресенчә, SPECC1L-kd U2OS күзәнәкләре озын күзәнәк формасын күрсәттеләр.Бу аерма күзәнәк тибына хас булырга мөмкин.PI3K-AKT сигнализациясен бастыру актин циткелетонына даими йогынты ясаса да, күзәнәк формасына эффект үзәк актин җепселләренең тыгызлыгы һәм оешмасы үзгәрү аркасында килеп чыккан киеренкелек үзгәрүләре белән билгеләнә.U2OS күзәнәкләрендә без SPECC1L-дефицит AJ үзгәрү һәм торгызу маркеры буларак күзәнәк формасы үзгәрүләрен кулландык.Ахырда, без фаразлыйбыз, SPECC1L дефицитында АКТ юлын тыю AJ тотрыклылыгын арттыра һәм CNCCда деламинацияне киметә.
Кызык, пан-АКТ дәрәҗәсе витрода һәм вивода кимегән, фосфориатланган 473-AKT дәрәҗәсенә өстәп, SPECC1L булмаганда, PI3K-AKT сигнализациясен AKT белок тотрыклылыгы яки әйләнеше дәрәҗәсендә көйләргә тәкъдим итә.SPECC1L һәм MID1 геннары, икесе дә Opitz / GBBB синдромы белән бәйле, 18,22 микротубулларны тотрыклыландыручы аксымнарны кодлыйлар.SPECC1L һәм MID1 арадаш микротубулны тотрыклыландыру механизмы тулысынча аңлашылмый.SPECC1L очракта, бу тотрыклыландыру 18 микротубулалар өлешенең көчәйтелгән ацетиляциясен үз эченә ала.SPECC1L АКТ кебек башка протеиннарны тотрыклыландыру өчен шундый ук механизм куллана ала.Күрсәтелгәнчә, АКТ протеинындагы лизин калдыкларының ацетиляциясе мембрана локализациясенең һәм фосфориляциянең кимүенә китерә38.Моннан тыш, аның мембранасын локализацияләү һәм активлаштыру өчен АКТтагы шул ук лизин калдыкларында K63 чылбырының таралуы таләп ителә39,40.SPECC1L белгечләре белән үзара бәйләнештә торучы берничә фактор арасында ике гибрид экранда ачылган чүпрә, дүрт - CCDC841, ECM2942, APC һәм UBE2I43 - протеин әйләнешенә яки тотрыклылыкка, яисә таралышка кагылган.SPECC1L AKT лизин калдыкларын тәрҗемә итүдән соң модификациядә катнашырга мөмкин, AKT тотрыклылыгына тәэсир итә.Ләкин, АКТ белокының локализациясендә һәм тотрыклылыгында SPECC1Lның критик роле аңлатыла.
SPECC1L экспрессиясендә виводагы җитди җитешсезлекләр нәтиҗәсендә AJ маркеры буяу һәм CNCC җитешсезлеге каплануы, шулай ук ​​апоптоз һәм эре эмбрион үлеме артты.Элеккеге докладлар күрсәткәнчә, апоптоз дәрәҗәсе арткан тычкан мутацияләре 44,45,46,47 һәм краниофациаль җитешсезлекләр белән бәйле.Нейр катламнарында яки фарингаль аркаларда күзәнәкләрнең артык үлүе 48,49,50 морфогенетик хәрәкәт өчен кирәкле күзәнәкләр саны җитмәүгә китерергә мөмкин.Киресенчә, безнең SPECC1L дефицит күзәнәк линияләре уртача кимегән SPECC1L экспрессиясе белән күзәнәк үлеменең артуы турында дәлилләрсез AJ үзгәрешләрен күрсәттеләр.Ләкин, бу Kd күзәнәкләрендә PI3K-AKT юлын химик тыю апоптозның артуына китерде.Шулай итеп, SPECC1L экспрессиясенең яки ​​функциянең уртача кимүе күзәнәкнең яшәвен тәэмин итә.Бу күзәтү белән туры килә, сирәк очрый торган Specc11 мутант яралгылар ур.E9.5, мөгаен, ген тоту эффективлыгының кимүе аркасында, аларның нейрон торбаларын ябып, соңрак үсештә туктый ала, еш кына краниофациаль кимчелекләр белән (S3 рәсем).Моның белән туры килә, краниофациаль аномальлек белән гетерозигозлы Specc1l яралгыларының сирәк очрый торганы, мөгаен, ген тоту эффективлыгы аркасында, шулай ук ​​зебрафишта табылу, ике SPECC1L ортологының берсе (спек1лб) соңрак эмбрион фенотипларын югалту. аскы иҗекләр һәм ике як ярыклар51.Шулай итеп, кеше пациентларында ачыкланган гетерозигозлы SPECC1L функциональ мутацияләр краниофациаль морфогенез вакытында SPECC1L функциясендә кечкенә бозулар китерергә мөмкин, аларның орофациаль ярларын аңлату өчен җитәрлек.SPECC1L нигезендә күзәнәкара контактларны көйләү палатогенезда һәм фарингаль аркаларның кушылуында да роль уйный ала.SPECC1L функциясен алга таба өйрәнү нейроепителий күзәнәк хәрәкәтендә һәм краниофациаль морфогенезда нейрон торбаны ябу вакытында CNCCдагы вакытлыча күзәнәк контактларның ролен ачыкларга ярдәм итәчәк.
U2OS остеосаркома контроле һәм SPECC1L-kd күзәнәкләре моңа кадәр тасвирланган (Саади һ.б., 2011).SPECC1L каршы антителалар моңа кадәр характерланган (Saadi et al., 2011).Анти-cat-катенин антителалары (куян; 1: 1000; Санта Крус, Даллас, Тех.) ), MO)), Э-кадерин (1: 1000; Абкам, Кембридж, MA), AP2A (1: 1000; Новус Биология, Литлтон, Коло.), SOX10 (1: 1000; 1000; Aviva Systems Biology, Сан-Диего . ). MO) сурәтләнгәнчә кулланылган..Актин филаментлары Акти-такта родамин фаллоидин белән буялган (tитоскелетон, Денвер, Колорадо).
U2OS контроль күзәнәкләре һәм SPECC1L-kd күзәнәкләре стандарт югары глюкоза DMEM культурасында эшкәртелде, 10% фетал бовины серумы белән тулыландырылды (Life Technologies, Carlsbad, CA).AJ үзгәрүләре өчен, 2 х 105 күзәнәк пыялага 0,1% чучка гелатины белән эшкәртелде (Сигма-Алдрич, Сент-Луис, МО) һәм күзәнәк формасының үзгәрүен күзәттеләр.Күзәнәкләр төрле күрсәтелгән вакыт пунктларында җыелдылар: чәчкәннән соң 4 сәгать (t = 1), чәчкәннән соң 24 сәгать (t = 2), күзәнәк формасы үзгәрмичә кушылу (t = 3), күзәнәк формасы үзгәрү (t = 4) , Күзәнәк формасы үзгәргәннән соң 24 с (t = 5) һәм күзәнәк формасы үзгәргәннән соң 48 с (t = 6) (1, 2, 3).PI3K-AKT юлын модульләштерү өчен, күзәнәкләр күрсәтелгән концентрацияләрдә PI3K-AKT ингибиторы wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) яки SC-79 активаторы (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Миннесота) белән культураланган.Химик матдәләр булган матдә көн саен үзгәртелә иде.
Рамка-рамка язмалары гадәти культура шартларында тере контрольдә һәм КД күзәнәкләрендә ясалды, һәм фаза контраст рәсемнәре 10 көн саен 7 көн эчендә җыелды.Рәсемнәр компьютер белән идарә ителгән Leica DM IRB инверсия микроскоп ярдәмендә алынган, QImaging Retiga-SRV камерасына тоташтырылган 10 × N-PLAN максаты.Тасвирлама вакытында күзәнәк культуралары 37 ° C дымлы атмосферада 5% CO2 белән сакланган.
Региональ мутант тычкан ресурс үзәгеннән (UC Davis, CA) ике ген тозак ES күзәнәк линиясе Specc1lgtDTM096 һәм Specc1lgtRRH046 итеп билгеләнгән Specc11 дефицит тычкан сызыкларын булдыру өчен кулланылды.Кыскасы, 129 / REJ ES күзәнәкләре C57BL6 бластостистларына укол салдылар.Нәтиҗә ясалган химерик ир-ат тычканнары C57BL6 хатын-кыз тычканнары белән тудырылды, токымны агути пальто төсе белән ачыклау өчен.Гетерозиготаларны ачыклау өчен ген тозак векторы кыстыргычлары булган.Тычканнар катнаш фонда 129 / REJ; C57BL6 сакланган.Генетик тозак векторын урнаштыру урынының урнашуы RT-PCR, геном эзлеклелеге һәм генетик тулыландыру белән расланды (өстәмә рәсем 1).Ике гетерозигозлы Specc1lGT тычканнарының CNCC нәселен эзләү өчен, ROSAmTmG (# 007576) һәм Wnt1-Cre (# 003829) тычканнар (Джексон лабораториясе, Бар Харбор, ME) Specc1l мутант эмбрионнарында ROSAmTmG һәм Wnt1-Cre аллеле җитештерү өчен кисештеләр.Тычканнардагы барлык экспериментлар Канзас Университеты Медицина Centerзәгенең хайваннарны карау һәм куллану институциональ комитеты раслаган протоколлар нигезендә үткәрелде.
Эмбриослар (1% формальдегид, 0,2% глютаральдегид, 2 мм MgCl2, 0,02% NP-40, 5 мм EGTA) бүлмә температурасында 60 минутка урнаштырылды.Х-гал буяу эремәсендә фиксацияләнгәннән соң (5 мм калий феррикианид, 5 мм калий ферроцянид, 2 мм MgCl2, 0,01% натрий дезокхолат, 0,02% NP-40, 1 мг / мл X-гал) Табаны үстерү 37 ° C температурада башкарылды. .1-6 сәгать эчендә ° C.Эмбриослар 4% PFAда урнаштырылган һәм визуальләштерелгән.
Көнбатыш блотлау өчен күзәнәкләр пассив лизис буферында лизланган (Промега, Фитчбург, WI) HALT протеаз ингибиторы катнашмасы белән тулыландырылган (Сигма-Алдрич, Сент-Луис, МО).Лизатлар 12% полиакриламид Мини-PROTEAN TGX әзер гельдә эшкәртелде (Био-Рад, Геркулес, Калифорния) һәм Иммобилон PVDF мембраналарына күчерелде (EMD Миллипор, Биллерика, MA).Мембраналар 5% сөттә ПБСта 0,1% Tween булган блокланган.Антитело төнлә 4 ° C яки бүлмә температурасында бер сәгать инкубацияләнде.Сигнал тудыру өчен Femto SuperSignal West ECL реагенты (Термо Фәнни, Уолтам, MA) кулланылды.Иммунотация өчен яралгылар төнлә 4% PFA / PBS һәм крипопрезервацияләнгән.Кисем криосекцияләре ПБСта 1% нормаль кәҗә сарысы (Термо Фәнни, Уолтам, Маг) һәм 0,1% Тритон X-100 (Сигма-Алдрич, Сент-Луис, МО) булган блокланган, аннары инкубаторда 4 ° C инкубаторда. төн.анти-антитела һәм флуоресцент икенчел антитела белән (1: 1000) 1 сәгать 4 ° C.ProLong алтын уртада (Термо Фәнни, Уолтам МА) тапланган бүлекләр урнаштырылды һәм Leica TCS SPE конфокаль микроскопы ярдәмендә яссы рәсемнәр алынды.Eachәрбер иммуностина ким дигәндә ике мутант яралгы циросекциясендә өч мөстәкыйль эксперимент рәвешендә башкарылды.Вәкиллек эксперименты күрсәтелә.
Күзәнәкләр үзгәртелгән RIPA буферында инкубацияләнде (20 мм Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 мм NaCl, 10% глицерол, 2 мм EDTA, һәм HALT протеаз ингибиторы (Сигма-Алдрич, Сент-Луис, МО) Кыскасы, лизатлар G магнитлы мускуллар белән әзерләнде (Life Technologies, Carlsbad, CA), аннары төнлә 4 ° C инкубацияләнде, анти-SPECC1L яки IgG белок G белгечләре белән SPECC1L чыгару өчен һәм Көнбатыш блотлау анти ярдәмендә кулланылды. -β-катенин антителасы югарыда тасвирланган Co-IP экспериментлары дүрт бәйсез экспериментның вәкиле.
Канзас университеты медицина үзәгендәге электрон микроскопия үзәгенә төп культуралы күзәнәкләр яки тычкан эмбрион тукымалары бирелгән.Кыскасы, үрнәкләр EMbed 812 резинасына (Электрон Микроскопия Фәннәре, Форт Вашингтон, ПА) урнаштырылган, төнлә 60 ° C полимерлаштырылган, һәм бриллиант пычак белән җиһазланган Leica UC7 ультрамикротомы ярдәмендә 80 нмга бүленгән.Секцияләр 100 кВ Lab6 мылтыгы белән җиһазландырылган JEOL JEM-1400 электрон микроскоп ярдәмендә визуальләштерелгән.
Бу мәкаләне ничек китерергә: Уилсон, НР һ.б.SPECC1L җитешмәве бүленгән буыннарның тотрыклылыгын арттыруга һәм краниаль нейрон крест күзәнәкләренең деламинациясенә китерә.фән.6, 17735;doi: 10.1038 / srep17735 (2016).
Сент-Жан, Дж.Нейраль крестны индукцияләү һәм дифференциацияләү.(Спрингер Фән + Бизнес Медиа; Landes Bioscience / Eurekah.com, 2006).
Кордеро, ДР һ.б.Краниаль нейрон крест күзәнәкләре хәрәкәттә: краниофациаль үсештә аларның роле.Америка медицина генетикасы журналы.А өлеше 155A, 270–279, doi: 10.1002 / ajmg.a.33702 (2011).
Боланд, РП Нейрокристопатия: аның үсеше һәм үсеше 20 ел эчендә.Педиатр.патология.лаборатория.медицина.17, 1-25 (1997).
Мангольд Э., Людвиг КУ һәм Нотен ММ орофациаль ярларның генетикасында алга китеш.Молекуляр медицинадагы тенденцияләр 17, 725–733, doi: 10.1016 / j.molmed.2011.07.007 (2011).
Мину, М. һәм Райли, FM Краниаль нейрон крест күзәнәк миграциясенең молекуляр механизмнары һәм краниофациаль үсеш вакытында паттеринг.7сеш 137, 2605–2621, doi: 10.1242 / dev.040048 (2010).
Диксон, М.Ж., Маразита, МЛ, Бити, ТХ һәм Мюррей, Дж.К.табигый аңлатма.Генетика 12, 167–178, doi: 10.1038 / nrg2933 (2011).
Инграм, CR һ.б.Терер, аяк-кулларның, краниофациаль өлкәнең гадәти булмаган морфогенезы, интерферон-көйләүче фактор-6 (Irf6) - тычканнар.Милли Генетта.38, 1335–1340, doi: 10.1038 / ng1903 (2006).
Пейрард-Янвид, М. һ.б.GRHL3 доминант мутацияләре ван дер Ваорд синдромына китерәләр һәм авыз перидермының үсешен бозалар.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016 / j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Харис, М.Ж., urрилов, ДМ Нейр трубасын ябу кимчелекләре булган тычкан мутацияләре исемлеген яңарту һәм нейр трубасын ябу турында тулы генетик аңлауга ирешү.Тумыштан килгән кимчелекләрне тикшерү.А өлеш, клиник һәм молекуляр тератология 88, 653–669, doi: 10.1002 / bdra.20676 (2010).
Фантауззо, КА & Сориано, П.Ген үсеше 28, 1005-1017, doi: 10.1101 / gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND and Murdoch, JN Disheveled: Нерв трубасы ябылу белән конвергент киңәюнең бәйләнеше.Неврология тенденцияләре.26, 453–455, doi: 10.1016 / S0166-2236 (03) 00212-1 (2003).